雙光子顯微鏡是結(jié)合了激光掃描共聚焦顯微鏡和雙光子激發(fā)技術(shù)的一種新技術(shù)。雙光子激發(fā)的基本原理是：在高光子密度的情況下，熒光分子可以同時(shí)吸收2個(gè)長(zhǎng)波長(zhǎng)的光子，在經(jīng)過一個(gè)很短的所謂激發(fā)態(tài)壽命的時(shí)間后，發(fā)射出一個(gè)波長(zhǎng)較短的光子；其效果和使用一個(gè)波長(zhǎng)為長(zhǎng)波長(zhǎng)一半的光子去激發(fā)熒光分子是相同的。雙（多）光子成像優(yōu)勢(shì)在于，具有更深的組織穿透深度，利用紅外光，能夠在層面檢測(cè)極限達(dá)1mm的組織區(qū)域；因信號(hào)背景比高，而具有更高的對(duì)比度；因激發(fā)體積小，具有定點(diǎn)激發(fā)的特性，具有更少的光毒性；激發(fā)波長(zhǎng)由紫外、可見光調(diào)整為紅外激發(fā)，能夠更加安全。優(yōu)勢(shì)來源于其雙光子光源的非線性光學(xué)效應(yīng)。熒光雙光子顯微鏡成像視野是多少剛好雙光...

在2020年12月22日，臨研所、病理科和科研處邀請(qǐng)北京大學(xué)王愛民副教授做了題目為“新一代微型雙光子顯微成像系統(tǒng)介紹及其在臨床醫(yī)療診斷”的學(xué)術(shù)報(bào)告。學(xué)術(shù)報(bào)告由臨研所醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)研究平臺(tái)潘琳老師主持。王愛民，北京大學(xué)信息科學(xué)技術(shù)學(xué)院副教授，畢業(yè)于北京大學(xué)物理系，獲學(xué)士、碩士學(xué)位，后于英國(guó)巴斯大學(xué)物理系獲博士學(xué)位。該研究組研發(fā)的微型雙光子顯微鏡，第1次在國(guó)際上獲得了小鼠大腦神經(jīng)元和神經(jīng)突觸清晰穩(wěn)定的動(dòng)態(tài)信號(hào)，該成果獲得了2017年度“中國(guó)光學(xué)進(jìn)展”和“中國(guó)科學(xué)進(jìn)展”，并被NatureMethods評(píng)為2018年度“年度方法--無限制行為動(dòng)物成像”。目前，該研究組正在研究新一代雙光子顯微成像技術(shù)在臨床診...

雙光子熒光顯微鏡是結(jié)合了激光掃描共聚焦顯微鏡和雙光子激發(fā)技術(shù)的一種新技術(shù)。雙光子激發(fā)的基本原理是：在高光子密度的情況下，熒光分子可以同時(shí)吸收2個(gè)長(zhǎng)波長(zhǎng)的光子，在經(jīng)過一個(gè)很短的所謂激發(fā)態(tài)壽命的時(shí)間后，發(fā)射出一個(gè)波長(zhǎng)較短的光子；其效果和使用一個(gè)波長(zhǎng)為長(zhǎng)波長(zhǎng)一半的光子去激發(fā)熒光分子是相同的。雙（多）光子成像優(yōu)勢(shì)在于，具有更深的組織穿透深度，利用紅外光，能夠在層面檢測(cè)極限達(dá)1mm的組織區(qū)域；因信號(hào)背景比高，而具有更高的對(duì)比度；因激發(fā)體積小，具有定點(diǎn)激發(fā)的特性，具有更少的光毒性；激發(fā)波長(zhǎng)由紫外、可見光調(diào)整為紅外激發(fā)，能夠更加安全。雙光子顯微鏡在生物醫(yī)學(xué)研究中有廣泛的應(yīng)用，可以觀察細(xì)胞內(nèi)的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)、蛋白...

雙光子顯微鏡的基本原理是：在高光子密度的情況下，熒光分子可以同時(shí)吸收2個(gè)長(zhǎng)波長(zhǎng)的光子，在經(jīng)過一個(gè)很短的所謂激發(fā)態(tài)壽命的時(shí)間后，發(fā)射出一個(gè)波長(zhǎng)較短的光子；其效果和使用一個(gè)波長(zhǎng)為長(zhǎng)波長(zhǎng)一半的光子去激發(fā)熒光分子是相同的。雙光子激發(fā)需要很高的光子密度，為了不損傷細(xì)胞，雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖激光器。這種激光器發(fā)出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量，其脈沖寬度只有100飛秒，而其周期可以達(dá)到80至100兆赫茲。在使用高數(shù)值孔徑的物鏡將脈沖激光的光子聚焦時(shí)，物鏡的焦點(diǎn)處的光子密度是比較高的，雙光子激發(fā)只發(fā)生在物鏡的焦點(diǎn)上，所以雙光子顯微鏡不需要共聚焦***，提高了熒光檢測(cè)效率。雙光子顯微鏡在組...

雙光子熒光顯微鏡是結(jié)合了激光掃描共聚焦顯微鏡和雙光子激發(fā)技術(shù)的一種新技術(shù)。雙光子激發(fā)的基本原理是：在高光子密度的情況下，熒光分子可以同時(shí)吸收2個(gè)長(zhǎng)波長(zhǎng)的光子，在經(jīng)過一個(gè)很短的所謂激發(fā)態(tài)壽命的時(shí)間后，發(fā)射出一個(gè)波長(zhǎng)較短的光子；其效果和使用一個(gè)波長(zhǎng)為長(zhǎng)波長(zhǎng)一半的光子去激發(fā)熒光分子是相同的。雙（多）光子成像優(yōu)勢(shì)在于，具有更深的組織穿透深度，利用紅外光，能夠在層面檢測(cè)極限達(dá)1mm的組織區(qū)域；因信號(hào)背景比高，而具有更高的對(duì)比度；因激發(fā)體積小，具有定點(diǎn)激發(fā)的特性，具有更少的光毒性；激發(fā)波長(zhǎng)由紫外、可見光調(diào)整為紅外激發(fā)，能夠更加安全。雙光子顯微鏡在生物醫(yī)學(xué)研究中有廣泛的應(yīng)用，可以觀察細(xì)胞內(nèi)的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)、蛋白...

雙光子顯微鏡的優(yōu)勢(shì)相比普通的顯微鏡電子顯微鏡可以觀察尺度更小的東西，冷凍電鏡更是可以觀察有活性的生物大分子，而雙光子顯微鏡有什么優(yōu)勢(shì)呢？它能做到什么普通光學(xué)顯微鏡做不到的事情嗎？原來，雙光子顯微鏡可以精確穿透較厚標(biāo)本進(jìn)行定點(diǎn)、觀察！由于電磁波的波長(zhǎng)越短，粒子性越強(qiáng)，受散射影響也就越大。雙光子顯微鏡將激發(fā)光源改為長(zhǎng)波長(zhǎng)激光，在增加了激光的穿透性的同時(shí)還減少了對(duì)細(xì)胞的毒性。除此之外，因?yàn)橹挥形镧R焦點(diǎn)處能發(fā)生雙光子激發(fā)效應(yīng)，所以掃描的精確度極高，也能提高激發(fā)光效率，減少被掃描點(diǎn)之外的熒光物質(zhì)消耗。雙光子顯微鏡已延伸到各個(gè)領(lǐng)域研究中，它能對(duì)樣品進(jìn)行三維觀察。國(guó)內(nèi)ultima雙光子顯微鏡商家剛好雙光子在...

實(shí)驗(yàn)從理論和實(shí)驗(yàn)上評(píng)估了多焦點(diǎn)v2PE顯微鏡的空間分辨率，并與單光子熒光顯微鏡進(jìn)行了對(duì)比，實(shí)驗(yàn)中v2PE的激發(fā)波長(zhǎng)為521nm，使用放大倍率為100倍的物鏡，尺寸為0.6AU，對(duì)直徑100nm的熒光顆粒進(jìn)行了測(cè)試性成像，共獲得40幅不同采樣深度的圖像合成為三維圖像。圖像在橫向和縱向的半高全寬分別是177nm和297nm，這些值接近顯微鏡的理論分辨率。后續(xù)還利用軟件模擬從理論上研究了多焦點(diǎn)v2PE顯微技術(shù)的空間分辨率，模擬計(jì)算顯示v2PE點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)(PSF)的橫向半高寬與單光子激發(fā)熒光(1PE)相似，軸向的半高寬較1PE減少，可以提高空間分辨率。優(yōu)勢(shì)來源于其雙光子光源的非線性光學(xué)效應(yīng)。進(jìn)口inv...

1990年初，當(dāng)WinfriedDenk剛從康奈爾大學(xué)博士畢業(yè)準(zhǔn)備前往瑞士讀博后時(shí)，他看了一本關(guān)于激光掃描顯微鏡的書，從中了解到非線性光學(xué)效應(yīng)——強(qiáng)光和物質(zhì)的相互作用。當(dāng)時(shí)，Denk有同事研究生物樣品中的鈣離子但苦于沒有強(qiáng)大的紫外激光器和光學(xué)元件，于是他就想到如果使用雙光子吸收就能夠繞開紫外，換言之，與其通過一個(gè)紫外光子激發(fā)標(biāo)記的鈣離子，通過兩個(gè)雙倍波長(zhǎng)的可見光光子也能激發(fā)相同的熒光。有了想法后馬上實(shí)驗(yàn)。借了一套染料飛秒激光器，Denk聯(lián)合他的導(dǎo)師WattWebb及其博士生JamesStrickler只用六個(gè)小時(shí)就完成了實(shí)驗(yàn)搭建，采集數(shù)據(jù)則用了兩到三天，于是一篇里程碑式的文章就此誕生了。這種雙...

WinfriedDenk較初使用的光源是染料飛秒激光器(100fs脈寬、630nm可見光波長(zhǎng))。雖然染料激光器對(duì)于實(shí)驗(yàn)室演示尚可，但是使用很不方便所以遠(yuǎn)未實(shí)現(xiàn)商用。很快雙光子顯微鏡的標(biāo)配光源就變成了飛秒鈦寶石激光器。除了固態(tài)光源優(yōu)勢(shì)，鈦寶石激光器還具有較寬的近紅外波長(zhǎng)調(diào)諧范圍，而近紅外相比可見光穿透更深，對(duì)生物樣品損傷更小。下圖是Thorlabs的雙光子和三光子顯微鏡配置，鈦寶石飛秒可調(diào)諧激光器位于平臺(tái)較左邊?？茖W(xué)家正在從雙光子轉(zhuǎn)向三光子顯微鏡。1996年，ChrisXu在康奈爾大學(xué)(Denk同導(dǎo)師實(shí)驗(yàn)室)讀博期間發(fā)明了三光子顯微鏡，如果雙光子吸收可行，那么三光子看起來也是自然的發(fā)展方向。三光...

1990年初，當(dāng)WinfriedDenk剛從康奈爾大學(xué)博士畢業(yè)準(zhǔn)備前往瑞士讀博后時(shí)，他看了一本關(guān)于激光掃描顯微鏡的書，從中了解到非線性光學(xué)效應(yīng)——強(qiáng)光和物質(zhì)的相互作用。當(dāng)時(shí)，Denk有同事研究生物樣品中的鈣離子但苦于沒有強(qiáng)大的紫外激光器和光學(xué)元件，于是他就想到如果使用雙光子吸收就能夠繞開紫外，換言之，與其通過一個(gè)紫外光子激發(fā)標(biāo)記的鈣離子，通過兩個(gè)雙倍波長(zhǎng)的可見光光子也能激發(fā)相同的熒光。有了想法后馬上實(shí)驗(yàn)。借了一套染料飛秒激光器，Denk聯(lián)合他的導(dǎo)師WattWebb及其博士生JamesStrickler只用六個(gè)小時(shí)就完成了實(shí)驗(yàn)搭建，采集數(shù)據(jù)則用了兩到三天，于是一篇里程碑式的文章就此誕生了。雙光子...

雙光子之源：飛秒激光雙光子吸收理論早在1931年就由諾獎(jiǎng)得主MariaGoeppertMayer提出，30年后因?yàn)橛辛思す獠诺玫綄?shí)驗(yàn)驗(yàn)證，但是到WinfriedDenk發(fā)明雙光子顯微鏡又用了將近30年。要理解雙光子的技術(shù)挑戰(zhàn)和飛秒激光發(fā)揮的重要作用，首先要了解其中的非線性過程。雙光子吸收相當(dāng)于和頻產(chǎn)生非線性過程，這要求極高的電場(chǎng)強(qiáng)度，而電場(chǎng)取決于聚焦光斑大小和激光脈寬。聚焦光斑越小，脈寬越窄，雙光子吸收效率越高。對(duì)于衍射極限顯微鏡，聚焦在樣品上的光斑大小只和物鏡NA和激光波長(zhǎng)有關(guān)，所以關(guān)鍵變量只剩下激光脈寬?；谝陨戏治觯軌蛞愿咧仡l(100MHz)輸出超短脈沖(100fs量級(jí))的飛秒激光器成...

在傳統(tǒng)寬場(chǎng)顯微鏡中，來自標(biāo)本不同縱深的光線都可投射到同一焦平面（感光元件）上，所以其成像是整個(gè)樣品的重疊像，沒有縱向分辨能力。單光子激光共聚焦顯微鏡用***有效濾除了雜散光，分辨率有了本質(zhì)上的提高，擁有了對(duì)樣品的特定焦平面精細(xì)成像的能力，可以進(jìn)行三維成像、動(dòng)態(tài)成像等。然而，***在濾除雜散光的同時(shí)也將大部分來自焦平面的熒光濾除了，只有很弱的熒光到達(dá)檢測(cè)器。若要提高信號(hào)強(qiáng)度，需要加大激發(fā)光功率，這又會(huì)導(dǎo)致對(duì)活細(xì)胞的光毒性和熒光分子的光漂白增加。雙光子顯微鏡比較大的優(yōu)勢(shì)來源于其雙光子光源的非線性光學(xué)效應(yīng)，與單光子共聚焦顯微鏡比較大的不同在于無須使用***限制光學(xué)散射，其具體優(yōu)勢(shì)如下。上海雙光子顯微...

首先我們來簡(jiǎn)單介紹一下激光掃描共聚焦和雙光子這兩種當(dāng)紅的顯微成像技術(shù)。激光掃描共聚焦顯微技術(shù)，是熒光顯微成像的一種，用于激發(fā)樣品的熒光信號(hào)并對(duì)其放大成像。在激光掃描共聚焦顯微鏡中，樣品焦平面上每一時(shí)刻只有一個(gè)點(diǎn)被激發(fā)光照射，縱然焦平面外也有激發(fā)光照射，但通過探測(cè)器前的（pinhole），有焦平面上的熒光信號(hào)能被探測(cè)器接收。也就是說，每個(gè)時(shí)刻，只有焦平面上一個(gè)點(diǎn)的信號(hào)被探測(cè)。通過點(diǎn)掃描的方式，一個(gè)個(gè)點(diǎn)的信號(hào)就可以組合出終的圖像。雙光子顯微鏡（包括多光子顯微鏡）同樣采用點(diǎn)掃描的方式得到圖像。不同的是，其采用的激發(fā)光波長(zhǎng)較長(zhǎng)，只有當(dāng)兩個(gè)（或更多）激發(fā)光光子幾乎同時(shí)轟擊熒光探針的時(shí)候才可能激發(fā)出熒光信...

隨著技術(shù)的發(fā)展，雙光子顯微鏡的性能得到不斷地優(yōu)化，結(jié)合它的特點(diǎn)，大致可以分成深和活兩個(gè)方面的提升。深要想讓激發(fā)激光進(jìn)入更深的層面，大致可從兩個(gè)方面入手，裝置優(yōu)化與標(biāo)本改造。關(guān)于裝置優(yōu)化，我們可以把激光束變得更細(xì)，使能量更加集中，就能讓激光穿透更深。關(guān)于標(biāo)本，其中影響光傳播的主要是物質(zhì)吸收和散射，解決這個(gè)問題，我們需要對(duì)樣本進(jìn)行透明化處理。一種方法是運(yùn)用某種物質(zhì)將標(biāo)本浸泡，使其中的物質(zhì)（主要是脂質(zhì)）被破壞或溶解。另一種方法是運(yùn)用電泳將脂質(zhì)電解，讓標(biāo)本“透明度”提高。高光子密度帶來的高能量容易損傷細(xì)胞，所以雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖激光器。這種激光器發(fā)出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量...

系統(tǒng)示意圖如圖1所示，紅外激光束從藍(lán)寶石激光器出射后，由一個(gè)光學(xué)參量振蕩器（OPO）轉(zhuǎn)化到可見光波段，產(chǎn)生的可見光脈沖寬度為200fs,重復(fù)頻率80MHz，波長(zhǎng)在490-750nm范圍內(nèi)可調(diào)諧。光束通過透鏡及平面鏡中繼到包含微透鏡陣列盤和陣列盤的共聚焦掃描單元中，形成用于熒光激發(fā)的多焦點(diǎn)光束。多焦點(diǎn)光束通過一個(gè)硅油浸潤(rùn)的物鏡成像到樣品上，激發(fā)熒光信號(hào)。熒光信號(hào)由同一個(gè)物鏡收集并傳輸?shù)疥嚵袌A盤，產(chǎn)生共焦效應(yīng)，隔離來自焦平面外的雜散光。雙光子顯微鏡的基本原理是：在高光子密度的情況下，熒光分子可以同時(shí)吸收 2 個(gè)長(zhǎng)波長(zhǎng)的光子。進(jìn)口激光熒光雙光子顯微鏡應(yīng)用美國(guó)霍華德·休斯醫(yī)學(xué)研究所在JaneliaFa...

從雙光子到三光子：科學(xué)家正在從雙光子轉(zhuǎn)向三光子顯微鏡。1996年，ChrisXu在康奈爾大學(xué)(Denk同導(dǎo)師實(shí)驗(yàn)室)讀博期間發(fā)明了三光子顯微鏡，如果雙光子吸收可行，那么三光子看起來也是自然的發(fā)展方向。三光子成像使用更長(zhǎng)的波長(zhǎng)，大約在1.3和1.7微米，其成像深度也比雙光子更深，目前記錄約為2.2毫米，人類大腦皮層厚約4毫米。相比雙光子顯微鏡，三光子還要求以較低重頻使用更強(qiáng)和更短的激光脈沖，而傳統(tǒng)的鈦寶石激光器難以達(dá)到這些要求，但是對(duì)于摻鐿光纖飛秒光參量放大器則非常容易，比如我們的Y-Fi光參量放大器(OPA)。在深度組織中以較長(zhǎng)時(shí)間對(duì)細(xì)胞成像，雙光子顯微鏡是當(dāng)前之選。進(jìn)口investigato...

在高光子密度的情況下，熒光分子可以同時(shí)吸收兩個(gè)長(zhǎng)波長(zhǎng)的光子，然后發(fā)射出一個(gè)波長(zhǎng)較短的光子，其效果和使用一個(gè)波長(zhǎng)為長(zhǎng)波長(zhǎng)一半的光子去激發(fā)熒光分子是相同的如煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH），在單光子激發(fā)時(shí)，在波長(zhǎng)為350nm光的激發(fā)下發(fā)出450nm熒光；而在雙光子激發(fā)時(shí)，可采用700nm的激發(fā)光得到450nm熒光。由于雙光子激發(fā)需要很高的光子密度，為了不損傷細(xì)胞，雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖激光器。這種激光器發(fā)出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量，從而可以減少光漂白和光毒性帶來的不利影響。雙光子顯微鏡放大倍數(shù)是多少？美國(guó)激光雙光子顯微鏡價(jià)格后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用碘化丙啶(PI)來指示細(xì)胞在7、8、9...

由于具有較高輸出功率的光源可以提高成像速度，在我們的實(shí)驗(yàn)中，時(shí)間分辨率主要是受OPO輸出可見光激光功率的限制。盡管在單點(diǎn)掃描系統(tǒng)中，v2PE激發(fā)會(huì)使得空間分辨率提高，但多聚焦v2PE顯微鏡具有與1PE多聚焦顯微鏡近乎相同的橫向分辨率，這主要是多聚焦成像和單點(diǎn)掃描技術(shù)之間的差異造成的。由于v2PE的激發(fā)體積小于1PE，引入圖像掃描技術(shù)可以進(jìn)一步提高空間分辨率，這種技術(shù)需要通過在陣列前引入額外的微透鏡陣列來實(shí)現(xiàn)。除此之外，由于可見光區(qū)域的共振效應(yīng)，可能會(huì)產(chǎn)生光漂白，因而為了延長(zhǎng)觀察時(shí)間，系統(tǒng)還需要對(duì)激發(fā)強(qiáng)度和曝光時(shí)間做進(jìn)一步優(yōu)化。用雙光子顯微鏡看看你的皮膚有沒有重?zé)ㄐ律?。美?guó)investigato...

光學(xué)顯微鏡從1590年發(fā)明以來，不斷發(fā)展，促進(jìn)生命科學(xué)日新月異的發(fā)現(xiàn)，幫助人類逐層打開生命本質(zhì)的大門。同時(shí)，生命科學(xué)的發(fā)展不斷給光學(xué)顯微鏡提出新的要求，促使成像理論和技術(shù)持續(xù)更新迭代?？茖W(xué)進(jìn)入21世紀(jì)，人們已經(jīng)不滿足于在體外研究細(xì)胞和組織，需要能夠更真實(shí)地探索生命，在體內(nèi)實(shí)時(shí)觀察細(xì)胞的發(fā)生和變化。此時(shí)，雙光子顯微鏡進(jìn)入了科學(xué)家的視野。在高光子密度的情況下，熒光分子可以同時(shí)吸收兩個(gè)長(zhǎng)波長(zhǎng)的光子，然后發(fā)射出一個(gè)波長(zhǎng)較短的光子，其效果和使用一個(gè)波長(zhǎng)為長(zhǎng)波長(zhǎng)一半的光子去激發(fā)熒光分子是相同的（圖1）。如煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH），在單光子激發(fā)時(shí)，在波長(zhǎng)為350nm光的激發(fā)下發(fā)出450nm熒光；而在...

雙光子顯微鏡是結(jié)合了激光掃描共聚焦顯微鏡和雙光子激發(fā)技術(shù)的一種新技術(shù)。雙光子激發(fā)的基本原理是：在高光子密度的情況下，熒光分子可以同時(shí)吸收2個(gè)長(zhǎng)波長(zhǎng)的光子，在經(jīng)過一個(gè)很短的所謂激發(fā)態(tài)壽命的時(shí)間后，發(fā)射出一個(gè)波長(zhǎng)較短的光子；其效果和使用一個(gè)波長(zhǎng)為長(zhǎng)波長(zhǎng)一半的光子去激發(fā)熒光分子是相同的。雙（多）光子成像優(yōu)勢(shì)在于，具有更深的組織穿透深度，利用紅外光，能夠在層面檢測(cè)極限達(dá)1mm的組織區(qū)域；因信號(hào)背景比高，而具有更高的對(duì)比度；因激發(fā)體積小，具有定點(diǎn)激發(fā)的特性，具有更少的光毒性；激發(fā)波長(zhǎng)由紫外、可見光調(diào)整為紅外激發(fā)，能夠更加安全。雙光子顯微鏡工作原理是利用兩個(gè)光子的能量相加達(dá)到熒光激發(fā)能量閾值，來激發(fā)樣品中...

雙光子顯微鏡在各領(lǐng)域研究中已有許多成功實(shí)例；生物領(lǐng)域：貝爾實(shí)驗(yàn)室的Svoboda等人研究了大腦皮層神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)鈣離子動(dòng)力學(xué)情形。利用雙光子顯微鏡觀察到的現(xiàn)象證明了鈣離子的增加依賴于肌體觸發(fā)的鈉離子作用電勢(shì)。信息領(lǐng)域：美國(guó)科學(xué)家Rentzepis提出了一種在現(xiàn)有二維光盤的基礎(chǔ)上將數(shù)據(jù)儲(chǔ)存擴(kuò)展到三維空間。由于雙光子激發(fā)具有作用精細(xì)體積小的特點(diǎn)，避免了層與層之間的互相干擾，較大地提高了數(shù)據(jù)儲(chǔ)存密度。雙光子顯微鏡已延伸到各個(gè)領(lǐng)域研究中，它能對(duì)樣品進(jìn)行三維觀察，其基礎(chǔ)雙光子激發(fā)效應(yīng)也具有極高的應(yīng)用價(jià)值。我們可以相信，隨著科技不斷發(fā)展，其他技術(shù)的不斷結(jié)合，雙光子顯微鏡將得到更大的發(fā)展與更廣的應(yīng)用。雙光子顯...

1990年初，當(dāng)WinfriedDenk剛從康奈爾大學(xué)博士畢業(yè)準(zhǔn)備前往瑞士讀博后時(shí)，他看了一本關(guān)于激光掃描顯微鏡的書，從中了解到非線性光學(xué)效應(yīng)——強(qiáng)光和物質(zhì)的相互作用。當(dāng)時(shí)，Denk有同事研究生物樣品中的鈣離子但苦于沒有強(qiáng)大的紫外激光器和光學(xué)元件，于是他就想到如果使用雙光子吸收就能夠繞開紫外，換言之，與其通過一個(gè)紫外光子激發(fā)標(biāo)記的鈣離子，通過兩個(gè)雙倍波長(zhǎng)的可見光光子也能激發(fā)相同的熒光。有了想法后馬上實(shí)驗(yàn)。借了一套染料飛秒激光器，Denk聯(lián)合他的導(dǎo)師WattWebb及其博士生JamesStrickler只用六個(gè)小時(shí)就完成了實(shí)驗(yàn)搭建，采集數(shù)據(jù)則用了兩到三天，于是一篇里程碑式的文章就此誕生了。用雙光...

新一代微型化雙光子熒光顯微鏡體積小，重只2.2克，適于佩戴在小動(dòng)物頭部顱窗上，實(shí)時(shí)記錄數(shù)十個(gè)神經(jīng)元、上千個(gè)神經(jīng)突觸的動(dòng)態(tài)信號(hào)。在大型動(dòng)物上，還可望實(shí)現(xiàn)多探頭佩戴、多顱窗不同腦區(qū)的長(zhǎng)時(shí)程觀測(cè)。相比單光子激發(fā)，雙光子激發(fā)具有良好的光學(xué)斷層、更深的生物組織穿透等優(yōu)勢(shì)，其橫向分辨率達(dá)到0.65μm，成像質(zhì)量與商品化大型臺(tái)式雙光子熒光顯微鏡可相媲美，遠(yuǎn)優(yōu)于目前領(lǐng)域內(nèi)主導(dǎo)的、美國(guó)腦科學(xué)計(jì)劃重要團(tuán)隊(duì)所研發(fā)的微型化寬場(chǎng)顯微鏡。采用雙軸對(duì)稱高速微機(jī)電系統(tǒng)轉(zhuǎn)鏡掃描技術(shù)，成像幀頻已達(dá)40Hz（256*256像素），同時(shí)具備多區(qū)域隨機(jī)掃描和每秒1萬線的線掃描能力。此外，采用自主設(shè)計(jì)可傳導(dǎo)920nm飛秒激光的光子晶體光...

首先我們來簡(jiǎn)單介紹一下激光掃描共聚焦和雙光子這兩種當(dāng)紅的顯微成像技術(shù)。激光掃描共聚焦顯微技術(shù)，是熒光顯微成像的一種，用于激發(fā)樣品的熒光信號(hào)并對(duì)其放大成像。在激光掃描共聚焦顯微鏡中，樣品焦平面上每一時(shí)刻只有一個(gè)點(diǎn)被激發(fā)光照射，縱然焦平面外也有激發(fā)光照射，但通過探測(cè)器前的（pinhole），有焦平面上的熒光信號(hào)能被探測(cè)器接收。也就是說，每個(gè)時(shí)刻，只有焦平面上一個(gè)點(diǎn)的信號(hào)被探測(cè)。通過點(diǎn)掃描的方式，一個(gè)個(gè)點(diǎn)的信號(hào)就可以組合出終的圖像。雙光子顯微鏡（包括多光子顯微鏡）同樣采用點(diǎn)掃描的方式得到圖像。不同的是，其采用的激發(fā)光波長(zhǎng)較長(zhǎng)，只有當(dāng)兩個(gè)（或更多）激發(fā)光光子幾乎同時(shí)轟擊熒光探針的時(shí)候才可能激發(fā)出熒光信...

共聚焦顯微可以呈現(xiàn)這么漂亮的圖像，是不是什么樣品都可以用共聚焦顯微鏡拍拍拍.....得到各種各樣清晰漂亮的圖像呢？答案是否定的，任何事物都有優(yōu)缺點(diǎn)，何況一臺(tái)儀器呢，共聚焦顯微鏡也是有自己的局限,共聚焦有哪些局限呢：1.共聚焦顯微鏡只能拍攝約200um以內(nèi)的的樣品，對(duì)于厚的或者樣品不能進(jìn)拍攝；2.共聚焦顯微鏡由于是逐點(diǎn)進(jìn)行掃描，對(duì)樣品的光毒性還是比較大的，特別是拍攝活細(xì)胞樣品時(shí)就更容易對(duì)樣品進(jìn)行淬滅；3.由于光照射的區(qū)域幾乎能通過這個(gè)Z軸的層面，所以對(duì)于空間定點(diǎn)光刺激的實(shí)驗(yàn)定點(diǎn)位置就不是特別精確；并且激光共聚焦顯微鏡沒有純紫外進(jìn)行激發(fā)，對(duì)于一些特殊激發(fā)波長(zhǎng)的實(shí)驗(yàn)，效率非常低。雙光子顯微鏡的基本原...

雙光子顯微鏡是結(jié)合了激光掃描共聚焦顯微鏡和雙光子激發(fā)技術(shù)的一種新技術(shù)。雙光子激發(fā)的基本原理是：在高光子密度的情況下，熒光分子可以同時(shí)吸收2個(gè)長(zhǎng)波長(zhǎng)的光子，在經(jīng)過一個(gè)很短的所謂激發(fā)態(tài)壽命的時(shí)間后，發(fā)射出一個(gè)波長(zhǎng)較短的光子；其效果和使用一個(gè)波長(zhǎng)為長(zhǎng)波長(zhǎng)一半的光子去激發(fā)熒光分子是相同的。雙（多）光子成像優(yōu)勢(shì)在于，具有更深的組織穿透深度，利用紅外光，能夠在層面檢測(cè)極限達(dá)1mm的組織區(qū)域；因信號(hào)背景比高，而具有更高的對(duì)比度；因激發(fā)體積小，具有定點(diǎn)激發(fā)的特性，具有更少的光毒性；激發(fā)波長(zhǎng)由紫外、可見光調(diào)整為紅外激發(fā)，能夠更加安全。雙光子顯微鏡的原理是什么？激光熒光雙光子顯微鏡原理在高光子密度的情況下，熒光分...

剛好雙光子在這兩點(diǎn)具有很大的優(yōu)勢(shì)在實(shí)際操作中成像的深度和樣品的關(guān)系很大，雙光子成像利用高亮度的熒光標(biāo)記材料，已經(jīng)有做到mm級(jí)別的穿透深度HighqualitycellularTPimagingwithhighsignal-to-backgroundratio(>100)andtissueimagingwithapenetrationdepthof2200μmhavebeenachievedwithP-QDasprobe.ExtremelyHighBrightnessfromPolymer-EncapsulatedQuantumDotsforTwo-photonCellularandDeep-t...

宇宙，浩瀚無垠，在數(shù)百億光年可觀測(cè)的空間里閃爍著上萬億個(gè)星系。人類1400克的大腦,如同一個(gè)小小的宇宙，包含了百億級(jí)神經(jīng)元和百萬億級(jí)的神經(jīng)突觸，其結(jié)構(gòu)和功能上極其復(fù)雜而精密的連接，涌現(xiàn)出意識(shí)和思想--大腦小宇宙隱藏著世界上較佳麗較深邃的奧秘。新千年伊始，世界科技強(qiáng)國(guó)紛紛啟動(dòng)有史以來比較大規(guī)模的腦科學(xué)研究計(jì)劃，人類探索大腦的波瀾壯闊的歷史畫卷正在展開。工欲善其事，必先利其器。目前，各國(guó)腦科學(xué)計(jì)劃的一個(gè)重要方向就是打造用于全景式解析腦連接圖譜和功能動(dòng)態(tài)圖譜的研究工具。其中，如何打破尺度壁壘，整合微觀神經(jīng)元和神經(jīng)突觸活動(dòng)與大腦整體的活動(dòng)和個(gè)體行為信息，是領(lǐng)域內(nèi)亟待解決的一個(gè)關(guān)鍵挑戰(zhàn)。顯微成像技術(shù)包含...

在高光子密度的情況下，熒光分子可以同時(shí)吸收兩個(gè)長(zhǎng)波長(zhǎng)的光子，然后發(fā)射出一個(gè)波長(zhǎng)較短的光子，其效果和使用一個(gè)波長(zhǎng)為長(zhǎng)波長(zhǎng)一半的光子去激發(fā)熒光分子是相同的如煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH），在單光子激發(fā)時(shí)，在波長(zhǎng)為350nm光的激發(fā)下發(fā)出450nm熒光；而在雙光子激發(fā)時(shí)，可采用700nm的激發(fā)光得到450nm熒光。由于雙光子激發(fā)需要很高的光子密度，為了不損傷細(xì)胞，雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖激光器。這種激光器發(fā)出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量，從而可以減少光漂白和光毒性帶來的不利影響。雙光子顯微鏡供應(yīng)商找因斯蔻浦(上海)生物科技有限公司。國(guó)外激光熒光雙光子顯微鏡磷光壽命計(jì)數(shù)許多生物醫(yī)學(xué)...

雙光子熒光顯微鏡是結(jié)合了激光掃描共聚焦顯微鏡和雙光子激發(fā)技術(shù)的一種新技術(shù)。雙光子激發(fā)的基本原理是：在高光子密度的情況下，熒光分子可以同時(shí)吸收2個(gè)長(zhǎng)波長(zhǎng)的光子，在經(jīng)過一個(gè)很短的所謂激發(fā)態(tài)壽命的時(shí)間后，發(fā)射出一個(gè)波長(zhǎng)較短的光子；其效果和使用一個(gè)波長(zhǎng)為長(zhǎng)波長(zhǎng)一半的光子去激發(fā)熒光分子是相同的。雙（多）光子成像優(yōu)勢(shì)在于，具有更深的組織穿透深度，利用紅外光，能夠在層面檢測(cè)極限達(dá)1mm的組織區(qū)域；因信號(hào)背景比高，而具有更高的對(duì)比度；因激發(fā)體積小，具有定點(diǎn)激發(fā)的特性，具有更少的光毒性；激發(fā)波長(zhǎng)由紫外、可見光調(diào)整為紅外激發(fā)，能夠更加安全。雙光子顯微鏡不需要共聚焦細(xì)孔，提高了熒光檢測(cè)效率。美國(guó)布魯克雙光子顯微鏡代...