國外布魯克雙光子顯微鏡成像技術(shù)

目前，世界各國的腦科學(xué)研究如火如荼，中國的腦計劃也即將啟動。其中，關(guān)于全景式解析腦連接圖譜和功能動態(tài)圖譜的研究成為重點研究方向，而如何打破尺度壁壘，融合微觀神經(jīng)元和神經(jīng)突觸活動與大腦整體的信息處理和個體行為信息，是領(lǐng)域內(nèi)亟待解決的一個關(guān)鍵挑戰(zhàn)。2021年1月6日，由北京大學(xué)分子醫(yī)學(xué)研究所牽頭，聯(lián)合北大信息科學(xué)技術(shù)學(xué)院電子學(xué)系、工學(xué)院以及中國人民******醫(yī)學(xué)科學(xué)院等組成的跨學(xué)科團(tuán)隊，在NatureMethods在線發(fā)表題為“Miniaturetwo-photonmicroscopyforenlargedfield-of-view,multi-plane,andlong-termbrainimaging”的文章。文中報道了第二代微型化雙光子熒光顯微鏡FHIRM-TPM2.0，其成像視野是該團(tuán)隊于2017年發(fā)布的低1代微型化顯微鏡的7.8倍，同時具備三維成像能力，獲取了小鼠在自由運動行為中大腦三維區(qū)域內(nèi)上千個神經(jīng)元清晰穩(wěn)定的動態(tài)功能圖像，并且實現(xiàn)了針對同一批神經(jīng)元長達(dá)一個月的追蹤記錄。雙光子顯微鏡是結(jié)合了雙光子技術(shù)和掃描共聚顯微鏡的一種新型熒光顯微鏡。國外布魯克雙光子顯微鏡成像技術(shù)

要想讓激發(fā)激光進(jìn)入更深的層面，大致可從兩個方面入手，裝置優(yōu)化與標(biāo)本改造。關(guān)于裝置優(yōu)化，我們可以把激光束變得更細(xì)，使能量更加集中，就能讓激光穿透更深。關(guān)于標(biāo)本，其中影響光傳播的主要是物質(zhì)吸收和散射，解決這個問題，我們需要對樣本進(jìn)行透明化處理。一種方法是運用某種物質(zhì)將標(biāo)本浸泡，使其中的物質(zhì)（主要是脂質(zhì)）被破壞或溶解。另一種方法是運用電泳將脂質(zhì)電解，讓標(biāo)本“透明度”提高。高光子密度帶來的高能量容易損傷細(xì)胞，所以雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖激光器。這種激光器發(fā)出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量，其脈沖達(dá)到最大值所持續(xù)的周期只有十萬億分之一秒，而其頻率可以達(dá)到80至100兆赫，這樣即能達(dá)到雙光子激發(fā)的高光子密度要求，又能不損傷細(xì)胞，使掃描能更好地進(jìn)行。國內(nèi)ultimainvestigator雙光子顯微鏡作用用雙光子顯微鏡看看你的皮膚有沒有重?zé)ㄐ律?/p>

在深度組織中以較長時間對活細(xì)胞成像，雙光子顯微鏡是當(dāng)前之選。雙光子和共聚焦顯微鏡都是通過激光激發(fā)樣品中的熒光標(biāo)記，使用探測器測量被激發(fā)的熒光。但是，共聚焦一般使用單模光纖耦合激光器，通過單光子激發(fā)熒光，而雙光子使用飛秒激光器，通過幾乎同時吸收兩個長波光子激發(fā)熒光。雙光子激發(fā)熒光的主要優(yōu)勢：雙光子比共聚焦使用的更長的波長，所以對組織的損傷更小且穿透更深。共聚焦的成像深度一般為100微米，雙光子則能達(dá)到250到500微米，甚至超過1毫米。另外，同時吸收兩個光子意味只有度聚焦點處能被激發(fā)，所以不會損傷焦平面之外的組織，并且生成更清晰的圖像。

Denk很快就將雙光子顯微鏡用于神經(jīng)元成像，而1997年在Svoboda測量完整老鼠大腦的錐體神經(jīng)元的感官刺激誘導(dǎo)樹突鈣離子動態(tài)后，雙光子顯微鏡的潛能開始完全凸顯。值得一提的是，霍華德·休斯醫(yī)學(xué)院Svoboda實驗室和Thorlabs在2016年合作推出了一種強大的多光子介觀顯微鏡，其成像視場達(dá)到5毫米，能夠跨多個腦區(qū)進(jìn)行高速功能成像。根據(jù)清華大學(xué)單一采購來源的**指導(dǎo)意見：這種顯微鏡的視場是普通雙光子顯微鏡的10倍。30年來，雙光子顯微鏡已成為較厚***生物組織三維成像中不可或缺的工具。從雙光子到三光子甚至四光子，這種非線性成像技術(shù)通常也被統(tǒng)稱為多光子顯微鏡。下圖統(tǒng)計了自1990年以來每年發(fā)表的多光子顯微鏡文章數(shù)量，發(fā)展速度可見一斑。雙光子顯微鏡中，同樣每個時刻只有焦平面上一個點的信號被探測，并且連焦平面外的熒光信號也不會有。

細(xì)胞內(nèi)鈣離子作為重要的信號分子其作用具有時間性和空間性。當(dāng)個細(xì)胞興奮時，產(chǎn)生了一個電沖動，此時，細(xì)胞外的鈣離子流入該細(xì)胞內(nèi)，促使該細(xì)胞分泌神經(jīng)遞質(zhì)，神經(jīng)遞質(zhì)與相鄰的下一級神經(jīng)細(xì)胞膜上的蛋白分子結(jié)合，促使這一級神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生新的電沖動。以此類推，神經(jīng)信號便一級一級地傳遞下去，從而構(gòu)成復(fù)雜的信號體系，終形成學(xué)習(xí)、記憶等大腦的高級功能。在哺乳動物神經(jīng)系統(tǒng)中，鈣離子同樣扮演著重要的信號分子的角色。靜息狀態(tài)下大部分神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度約為50-100nM，而細(xì)胞興奮時鈣離子濃度能瞬間上升10-100倍，增加的鈣離子對于突觸囊泡胞吐釋放神經(jīng)遞質(zhì)的過程必不可少。眾所周知，只有游離鈣才具有生物學(xué)活性，而細(xì)胞質(zhì)內(nèi)鈣離子濃度由鈣離子的內(nèi)外流平衡所決定，同時也受鈣結(jié)合蛋白的影響。細(xì)胞外鈣離子內(nèi)流的方式有很多種，其中包括電壓門控鈣離子通道、離子型谷氨酰胺受體、煙堿型膽堿能受體（nAChR）和瞬時受體電位C型通道（TRPC）等。神經(jīng)元鈣成像的原理就是利用特殊的熒光染料或鈣離子指示劑將神經(jīng)元中鈣離子濃度的變化通過熒光強度表現(xiàn)出來，以反映神經(jīng)元活性。該方法可以同時觀察多個功能或位置相關(guān)的腦細(xì)胞。由于雙光子顯微鏡使用的是可見光或近紅外光作為激發(fā)光源，適用于長時間的研究。美國雙光子顯微鏡成像視野一般是多少

雙光子顯微鏡可以精確穿透較厚標(biāo)本進(jìn)行定點、有生命體的觀察！國外布魯克雙光子顯微鏡成像技術(shù)

雙光子顯微鏡的優(yōu)勢相比普通的顯微鏡電子顯微鏡可以觀察尺度更小的東西，冷凍電鏡更是可以觀察有活性的生物大分子，而雙光子顯微鏡有什么優(yōu)勢呢？它能做到什么普通光學(xué)顯微鏡做不到的事情嗎？原來，雙光子顯微鏡可以精確穿透較厚標(biāo)本進(jìn)行定點、觀察！由于電磁波的波長越短，粒子性越強，受散射影響也就越大。雙光子顯微鏡將激發(fā)光源改為長波長激光，在增加了激光的穿透性的同時還減少了對細(xì)胞的毒性。除此之外，因為只有物鏡焦點處能發(fā)生雙光子激發(fā)效應(yīng)，所以掃描的精確度極高，也能提高激發(fā)光效率，減少被掃描點之外的熒光物質(zhì)消耗。國外布魯克雙光子顯微鏡成像技術(shù)