布魯克雙光子顯微鏡原理

美國霍華德·休斯醫(yī)學(xué)研究所在Janelia Farm ResearchCampus的吉娜博士小組與來自中科院上海光機(jī)所強(qiáng)場激光物理國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的王琛博士較近成功將一種新的自適應(yīng)光學(xué)的方法和雙光子顯微鏡結(jié)合，研制出一種新的自適應(yīng)光學(xué)雙光子熒光顯微鏡。通過校正小鼠大腦的像差，在視覺皮層的不同深度處均獲得了提高數(shù)倍的成像分辨率和信號強(qiáng)度，明顯改進(jìn)了成像質(zhì)量，使得原來在鼠腦中不可見或者模糊的細(xì)節(jié)變得清晰可見，她們成功將該方法應(yīng)用于老鼠視覺皮層第五層（約500μm）的形貌結(jié)構(gòu)成像和鈣離子功能成像。這一新的自適應(yīng)光學(xué)方法，使得在小鼠深層區(qū)域成像中獲得近衍射極限的成像分辨率成為現(xiàn)實(shí)。這一成果發(fā)表在較新一期的《Nature Methods》。雙光子顯微鏡有哪些應(yīng)用呢？布魯克雙光子顯微鏡原理

2008年錢永健等人由于熒光蛋白（GFP，綠色熒光蛋白）的發(fā)現(xiàn)和使用，獲得了諾貝爾化學(xué)獎，是對熒光成像技術(shù)的一次巨大肯定和推動。光學(xué)成像本身具有高分辨率、高通量、非侵入和非毒性等特點(diǎn)，再與熒光蛋白以及熒光染料等標(biāo)記物在細(xì)胞中的定位與表達(dá)技術(shù)相結(jié)合，使得科學(xué)家可以特異性的分辨生物體乃至細(xì)胞內(nèi)部不同結(jié)構(gòu)與成分，并且能夠在生命體和細(xì)胞仍具有活性的狀態(tài)下（狀態(tài)）對其功能進(jìn)行動態(tài)觀察。這就使得熒光成像技術(shù)成為了無可替代的，生物學(xué)家現(xiàn)今較為重要的技術(shù)手段之一。目前，大多數(shù)細(xì)胞生物學(xué)和生理學(xué)研究主要還是在離體培養(yǎng)的細(xì)胞體系中研究。然而與細(xì)胞生物學(xué)研究有所不同的是，大腦的功能研究的整體性和原位性顯得更加關(guān)鍵：只研究分離的神經(jīng)元無法解釋神經(jīng)系統(tǒng)的功能和規(guī)律。由于被觀測的信號會受到樣本組織的散射和吸收，根本無法穿透如此深的組織進(jìn)行成像。而雙光子顯微鏡（Two-photonMicroscopy，簡稱TPM）的發(fā)明，則為此類研究帶來了希望。雙光子顯微鏡特有的非線性光學(xué)特性，再加上其工作波長處在紅外區(qū)域等特點(diǎn)，令其在生物體組織內(nèi)的穿透深度較大提高，使得雙光子顯微鏡成為神經(jīng)科學(xué)家進(jìn)行神經(jīng)成像較理想的工具。進(jìn)口布魯克雙光子顯微鏡熒光壽命計(jì)數(shù)雙光子顯微鏡廠家就找因斯蔻浦(上海)生物科技有限公司；

第二代微型化雙光子熒光顯微鏡 FHIRM-TPM 2.0，其成像視野是該團(tuán)隊(duì)于2017年發(fā)布的代微型化顯微鏡的7.8倍，同時(shí)具備三維成像能力，獲取了小鼠在自由運(yùn)動行為中大腦三維區(qū)域內(nèi)上千個神經(jīng)元清晰穩(wěn)定的動態(tài)功能圖像，并且實(shí)現(xiàn)了針對同一批神經(jīng)元長達(dá)一個月的追蹤記錄。在一批“早鳥項(xiàng)目”中，該系統(tǒng)已被多個研究組應(yīng)用于不同的模式動物和行為范式，如小鼠的社交新穎性識別、斑胸草雀受調(diào)控后大腦特定神經(jīng)元變化、新型神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿探針的傳導(dǎo)適應(yīng)性分析以及獼猴三腦區(qū)成像等多項(xiàng)研究。

系統(tǒng)示意圖如圖1所示，紅外激光束從藍(lán)寶石激光器出射后，由一個光學(xué)參量振蕩器（OPO）轉(zhuǎn)化到可見光波段，產(chǎn)生的可見光脈沖寬度為200 fs, 重復(fù)頻率80 MHz，波長在490-750nm范圍內(nèi)可調(diào)諧。光束通過透鏡及平面鏡中繼到包含微透鏡陣列盤和陣列盤的共聚焦掃描單元中，形成用于熒光激發(fā)的多焦點(diǎn)光束。多焦點(diǎn)光束通過一個硅油浸潤的物鏡成像到樣品上，激發(fā)熒光信號。熒光信號由同一個物鏡收集并傳輸?shù)疥嚵袌A盤，產(chǎn)生共焦效應(yīng)，隔離來自焦平面外的雜散光。雙光子顯微鏡能夠進(jìn)行指標(biāo)成像；

共聚焦顯微可以呈現(xiàn)這么漂亮的圖像，是不是什么樣品都可以用共聚焦顯微鏡拍拍拍.....得到各種各樣清晰漂亮的圖像呢？答案是否定的，任何事物都有優(yōu)缺點(diǎn)，何況一臺儀器呢，共聚焦顯微鏡也是有自己的局限,共聚焦有哪些局限呢：1.共聚焦顯微鏡只能拍攝約200um以內(nèi)的的樣品，對于厚的或者樣品不能進(jìn)拍攝；2. 共聚焦顯微鏡由于是逐點(diǎn)進(jìn)行掃描，對樣品的光毒性還是比較大的，特別是拍攝活細(xì)胞樣品時(shí)就更容易對樣品進(jìn)行淬滅；3. 由于光照射的區(qū)域幾乎能通過這個Z軸的層面，所以對于空間定點(diǎn)光刺激的實(shí)驗(yàn)定點(diǎn)位置就不是特別精確；并且激光共聚焦顯微鏡沒有純紫外進(jìn)行激發(fā)，對于一些特殊激發(fā)波長的實(shí)驗(yàn)，效率非常低。雙光子顯微鏡的基本原理是：在高光子密度的情況下，熒光分子可以同時(shí)吸收 2 個長波長的光子，在經(jīng)過一個很短的所謂激發(fā)態(tài)壽命的時(shí)間后，發(fā)射出一個波長較短的光子；其效果和使用一個波長為長波長一半的光子去激發(fā)熒光分子是相同的。雙光子激發(fā)需要很高的光子密度，為了不損傷細(xì)胞，雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖激光器。這種激光器發(fā)出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量，其脈沖寬度只有 100 飛秒，而其周期可以達(dá)到 80至100兆赫茲。顯微成像技術(shù)包含：雙光子顯微鏡、寬場熒光顯微鏡、共聚焦顯微鏡、全內(nèi)反射熒光顯微鏡等多種成像方式。進(jìn)口2PPLUS雙光子顯微鏡圖像對比度

雙光子顯微鏡觀察到的現(xiàn)象證明了鈣離子的增加依賴于肌體觸發(fā)的鈉離子作用電勢。布魯克雙光子顯微鏡原理

在2020年12月22日，臨研所、病理科和科研處邀請北京大學(xué)王愛民副教授做了題目為“新一代微型雙光子顯微成像系統(tǒng)介紹及其在臨床醫(yī)療診斷”的學(xué)術(shù)報(bào)告。學(xué)術(shù)報(bào)告由臨研所醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)研究平臺潘琳老師主持。王愛民，北京大學(xué)信息科學(xué)技術(shù)學(xué)院副教授，畢業(yè)于北京大學(xué)物理系，獲學(xué)士、碩士學(xué)位，后于英國巴斯大學(xué)物理系獲博士學(xué)位。該研究組研發(fā)的微型雙光子顯微鏡，第1次在國際上獲得了小鼠大腦神經(jīng)元和神經(jīng)突觸清晰穩(wěn)定的動態(tài)信號，該成果獲得了2017年度“中國光學(xué)進(jìn)展”和“中國科學(xué)進(jìn)展”，并被Nature Methods評為2018年度“年度方法--無限制行為動物成像”。目前，該研究組正在研究新一代雙光子顯微成像技術(shù)在臨床診斷中的應(yīng)用，為未來即時(shí)病理、離體組織檢測、術(shù)中診斷等提供新的影像手段和分析方法。布魯克雙光子顯微鏡原理