激光熒光雙光子顯微鏡原理

雙光子顯微鏡在各領域研究中已有許多成功實例；生物領域：貝爾實驗室的Svoboda等人研究了大腦皮層神經元細胞內鈣離子動力學情形。利用雙光子顯微鏡觀察到的現(xiàn)象證明了鈣離子的增加依賴于肌體觸發(fā)的鈉離子作用電勢。信息領域：美國科學家Rentzepis提出了一種在現(xiàn)有二維光盤的基礎上將數(shù)據(jù)儲存擴展到三維空間。由于雙光子激發(fā)具有作用精細體積小的特點，避免了層與層之間的互相干擾，較大地提高了數(shù)據(jù)儲存密度。雙光子顯微鏡已延伸到各個領域研究中，它能對樣品進行三維觀察，其基礎雙光子激發(fā)效應也具有極高的應用價值。我們可以相信，隨著科技不斷發(fā)展，其他技術的不斷結合，雙光子顯微鏡將得到更大的發(fā)展與更廣的應用。雙光子顯微鏡比單光子共聚焦顯微鏡較大的不同在于無須使用孔限制光學散射。激光熒光雙光子顯微鏡原理

摻雜可以明顯影響碳點（CDs）的發(fā)射和激發(fā)特性，使雙光子碳點（TP-CDs）具有本征雙光子激發(fā)特性和605nm的紅光發(fā)射特性。在638nm激光照射下，除了長波激發(fā)和發(fā)射外，還可以實現(xiàn)活性氧（ROS）的產生，這為光動力技術提供了巨大的可能性。更重要的是，通過各種表征和理論模擬證實，摻雜誘導的N雜環(huán)在TP-CDs與RNA的親和力中起關鍵作用。這種親和力不僅為實現(xiàn)核仁特異性自我靶向提供了可能，而且通過ROS斷裂RNA鏈解離TP-CDs@RNA復合物，賦予治療過程中的熒光變異。TP-CDs結合了ROS的產生能力、光動力療法（PDT）過程中的熒光變化、長波激發(fā)和發(fā)射特性以及核仁的特異性自靶向性，可以認為是一種結合核仁動態(tài)變化實時處理的智能CDs。國外bruker雙光子顯微鏡成像技術雙光子顯微鏡在生物醫(yī)學研究中有廣泛的應用，可以觀察細胞內的亞細胞結構、蛋白質分布、細胞活動等。

雙光子顯微成像技術不是什么新技術，早在20多年前就有了，目前已經在生命科學和材料科學中廣泛應用。幾年前雙光子過期后，已經推出自己的雙光子顯微鏡的廠家估計不少于10家以上。即便如此，世界上很多實驗室都搭雙光子，自己搭的好處有很多，首先是便宜，尤其是實驗室已經有飛秒激光器，那就更很省錢了。其次是靈活，可以選擇針對特殊用途的搭配，改動也靈活。好處就是可以鍛煉隊伍，一趟走下來可以把新手帶出來，后期維護也更加自由。當然壞處也不少，首先是操心，特別是第1次搭的時候，開始要想方案，后來要解決各種實際問題。其次是花時間，加上買配件的時間，比買一臺現(xiàn)成的商業(yè)化雙光子耗時長?，F(xiàn)在已經有不少關于如何搭雙光子顯微鏡的文章，各種protocol，大多是老外寫的，中文的較少。其實完全自己搭一套好用的系統(tǒng)還是不容易的，尤其是沒有經驗的時候，容易走彎路，多花錢，也多花時間，再加上雙光子的重要器件都需要從國外購買，在國內買這些東西耗時較長。因此，我想總結一下我們的經驗，貼出來分享，希望能幫到想自己動手的實驗室，

雙光子顯微鏡是結合了激光掃描共聚焦顯微鏡和雙光子激發(fā)技術的一種新技術。雙光子激發(fā)的基本原理是：在高光子密度的情況下，熒光分子可以同時吸收2個長波長的光子，在經過一個很短的所謂激發(fā)態(tài)壽命的時間后，發(fā)射出一個波長較短的光子；其效果和使用一個波長為長波長一半的光子去激發(fā)熒光分子是相同的。雙（多）光子成像優(yōu)勢在于，具有更深的組織穿透深度，利用紅外光，能夠在層面檢測極限達1mm的組織區(qū)域；因信號背景比高，而具有更高的對比度；因激發(fā)體積小，具有定點激發(fā)的特性，具有更少的光毒性；激發(fā)波長由紫外、可見光調整為紅外激發(fā)，能夠更加安全。雙光子顯微鏡還可以對一些具有特性的染料細胞進行實驗，還有一些短波長可以利用雙光子特性進行特定實驗。

剛好雙光子在這兩點具有很大的優(yōu)勢在實際操作中成像的深度和樣品的關系很大，雙光子成像利用高亮度的熒光標記材料，已經有做到mm級別的穿透深度HighqualitycellularTPimagingwithhighsignal-to-backgroundratio(>100)andtissueimagingwithapenetrationdepthof2200μmhavebeenachievedwithP-QDasprobe.ExtremelyHighBrightnessfromPolymer-EncapsulatedQuantumDotsforTwo-photonCellularandDeep-tissueImaging:ScientificReports:NaturePublishingGroup雙光子顯微鏡有這么多優(yōu)點，那么雙光子顯微鏡有哪些應用呢？國內熒光雙光子顯微鏡熒光探測

雙光子顯微鏡可以用于局部微蝕鐳射磨皮后的膠原重塑的檢測。激光熒光雙光子顯微鏡原理

由于具有較高輸出功率的光源可以提高成像速度，在我們的實驗中，時間分辨率主要是受OPO輸出可見光激光功率的限制。盡管在單點掃描系統(tǒng)中，v2PE激發(fā)會使得空間分辨率提高，但多聚焦v2PE顯微鏡具有與1PE多聚焦顯微鏡近乎相同的橫向分辨率，這主要是多聚焦成像和單點掃描技術之間的差異造成的。由于v2PE的激發(fā)體積小于1PE，引入圖像掃描技術可以進一步提高空間分辨率，這種技術需要通過在陣列前引入額外的微透鏡陣列來實現(xiàn)。除此之外，由于可見光區(qū)域的共振效應，可能會產生光漂白，因而為了延長觀察時間，系統(tǒng)還需要對激發(fā)強度和曝光時間做進一步優(yōu)化。激光熒光雙光子顯微鏡原理