美國(guó)可升級(jí)膜片鉗技術(shù)

膜片鉗技術(shù)是1976年由諾貝爾獎(jiǎng)得主Neher和Sakmann發(fā)展起來(lái)的一種記錄胞膜離子通道電生理活動(dòng)的技術(shù)。該技術(shù)的應(yīng)用將細(xì)胞水平和分子水平的生理學(xué)研究聯(lián)系在一起，已成為現(xiàn)代細(xì)胞電生理研究的常規(guī)方法，廣泛應(yīng)用于生物、生理、病理、藥理、神經(jīng)科學(xué)、植物和微生物等領(lǐng)域并取得了豐碩的研究成果。膜片鉗技術(shù)點(diǎn)燃了細(xì)胞和分子水平的生理學(xué)研究的**之火,與基因克隆技術(shù)(genecloning)并駕齊驅(qū),給生命科學(xué)研究帶來(lái)了巨大的前進(jìn)動(dòng)力。鈣成像技術(shù)被廣泛應(yīng)用于實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)神經(jīng)元、心肌以及多種細(xì)胞胞內(nèi)鈣離子的變化，從而檢測(cè)神經(jīng)元、心肌的活動(dòng)情況。這些技術(shù)是人們觀測(cè)神經(jīng)以及多種細(xì)胞活動(dòng)為直接的手段，現(xiàn)已發(fā)展為生命科學(xué)研究的熱點(diǎn)，也是國(guó)家自然科學(xué)基金等鼓勵(lì)申報(bào)的重要領(lǐng)域。早期的研究多使用雙電極電壓鉗技術(shù)作細(xì)胞內(nèi)電活動(dòng)的記錄。美國(guó)可升級(jí)膜片鉗技術(shù)

離子選擇性（selectivity）（大小和電荷）∶某一種離子只能通過(guò)與其相應(yīng)的通道跨膜擴(kuò)散（安靜∶K＞Na100倍、興奮;Na＞K10-20倍）;各離子通道在不同狀態(tài)下，對(duì)相應(yīng)離子的通透性不同。門(mén)控特性（Gating）∶失活狀態(tài)不僅是通道處于關(guān)閉狀態(tài)，而且只有在經(jīng)過(guò)一個(gè)額外刺激使通道從失活關(guān)閉狀態(tài)進(jìn)入靜息關(guān)閉狀態(tài)后，通道才能再度接受外界刺激而***開(kāi)放。離子通道的功能(FunctionoflonChannels)1.產(chǎn)生細(xì)胞生物電現(xiàn)象，與細(xì)胞興奮性相關(guān)。2.神經(jīng)遞質(zhì)的釋放、腺體的分泌、肌肉的運(yùn)動(dòng)、學(xué)習(xí)和記憶3.維持細(xì)胞正常形態(tài)和功能完整性膜離子通道的基因變異及功能障礙與許多疾病有關(guān)，某些先天性與后天獲得性疾病是離子通道基因缺陷與功能改變的結(jié)果，稱(chēng)為離子通道?。╥onchannelpathies）。美國(guó)高通量全自動(dòng)膜片鉗離子通道維持細(xì)胞正常形態(tài)和功能完整性。

離子通道的近代觀念源于Hodgkin、Huxley、Katz等人在20世紀(jì)30—50年代的開(kāi)創(chuàng)性研究。在1902年，Bernstein創(chuàng)造性地將Nernst的理論應(yīng)用到生物膜上，提出了“膜學(xué)說(shuō)”。他認(rèn)為在靜息狀態(tài)下，細(xì)胞膜只對(duì)鉀離子具有通透性；而當(dāng)細(xì)胞興奮的瞬間，膜的破裂使其喪失了選擇通透性，所有的離子都可以自由通過(guò)。Cole等人在1939年進(jìn)行的高頻交變電流測(cè)量實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng)動(dòng)作電位被觸發(fā)時(shí)，雖然細(xì)胞的膜電導(dǎo)大為增加，但膜電容卻只略有下降，這個(gè)事實(shí)表明膜學(xué)說(shuō)所宣稱(chēng)的膜破裂的觀點(diǎn)是不可靠的。1949年Cole在玻璃微電極技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)明了電壓鉗位（voltage clamp technique）技術(shù)

在心血管藥理研究中的應(yīng)用，隨著膜片鉗技術(shù)在心血管方面的廣泛應(yīng)用，對(duì)血管疾病和藥物作用的認(rèn)識(shí)不僅得到了不斷更新，而且在其病因?qū)W與藥理學(xué)方面還形成了許多新的觀點(diǎn)。正如諾貝爾基金會(huì)在頒獎(jiǎng)時(shí)所說(shuō)：“Neher和Sadmann的貢獻(xiàn)有利于了解不同疾病機(jī)理，為研制新的更為的藥物開(kāi)辟了道路”。創(chuàng)新藥物研究與高通量篩選，目前在離子通道高通量篩選中主要是進(jìn)行樣品量大、篩選速度占優(yōu)勢(shì)、信息量要求不太高的初級(jí)篩選。近幾年，分別形成了以膜片鉗和熒光探針為基礎(chǔ)的兩大主流技術(shù)市場(chǎng)。將電生理研究信息量大、靈敏度高等特點(diǎn)與自動(dòng)化、微量化技術(shù)相結(jié)合，產(chǎn)生了自動(dòng)化膜片鉗等一些新技術(shù)。通過(guò)研究離子通道的離子流， 從而了解離子運(yùn)輸、信號(hào)傳遞等信息。

膜片鉗的基本原理則是利用負(fù)反饋電子線路，將微電極前列所吸附的一個(gè)至幾個(gè)平方微米的細(xì)胞膜的電位固定在一定水平上，對(duì)通過(guò)通道的微小離子電流作動(dòng)態(tài)或靜態(tài)觀察，從而研究其功能。膜片鉗技術(shù)實(shí)現(xiàn)膜電流固定的關(guān)鍵步驟是在玻璃微電極前列邊緣與細(xì)胞膜之間形成高阻密封，其阻抗數(shù)值可達(dá)10～100GΩ(此密封電阻是指微電極內(nèi)與細(xì)胞外液之間的電阻)。由于此阻值如此之高，故基本上可看成絕緣，其上之電流可看成零，形成高阻密封的力主要有氫健、范德華力、鹽鍵等。此密封不僅電學(xué)上近乎絕緣，在機(jī)械上也是較牢固的。又由于玻璃微電極前列管徑很小，其下膜面積只約1μm2，在這么小的面積上離子通道數(shù)量很少，一般只有一個(gè)或幾個(gè)通道，經(jīng)這一個(gè)或幾個(gè)通道流出的離子數(shù)量相對(duì)于整個(gè)細(xì)胞來(lái)講很少，可以忽略，也就是說(shuō)電極下的離子電流對(duì)整個(gè)細(xì)胞的靜息電位的影響可以忽略，那么，只要保持電極內(nèi)電位不變，則電極下的一小片細(xì)胞膜兩側(cè)的電位差就不變，從而實(shí)現(xiàn)電位固定。在細(xì)胞膜的電學(xué)模型中，膜電容和膜電導(dǎo)構(gòu)成了一個(gè)并聯(lián)回路。德國(guó)細(xì)胞膜片鉗離子電流

在膜電位改變時(shí)，在電場(chǎng)的作用下，重新分布導(dǎo)致通道的關(guān)閉，同時(shí)有電荷移動(dòng)，稱(chēng)為門(mén)控電流。美國(guó)可升級(jí)膜片鉗技術(shù)

在大多數(shù)膜片鉗實(shí)驗(yàn)，要求所有實(shí)驗(yàn)儀器及設(shè)備均具有良好的機(jī)械穩(wěn)定性，以使微電極與細(xì)胞膜之間的相對(duì)運(yùn)動(dòng)盡可能小。防震工作臺(tái)放置倒置顯微鏡和與之固定連接的微操縱器，其他設(shè)備置于臺(tái)外。屏蔽罩由銅絲網(wǎng)制成，接地以防止周?chē)h(huán)境的雜散電場(chǎng)對(duì)膜片鉗放大器的探頭電路的干擾。儀器設(shè)備架要靠近工作臺(tái)，便于測(cè)量?jī)x器與光學(xué)儀器配接。倒置顯微鏡是膜片鉗實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)的主要光學(xué)部件，它不僅具有較好的視覺(jué)效果，便于將玻璃電極與細(xì)胞的頂部接觸，而且是借助移動(dòng)物鏡來(lái)實(shí)現(xiàn)聚焦，具有較好的機(jī)械穩(wěn)定性。視頻監(jiān)視器主要是用來(lái)監(jiān)視實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的操作，特別是能將封接參數(shù)（如封接阻抗）與細(xì)胞的形態(tài)對(duì)應(yīng)，以實(shí)現(xiàn)良好的封接。美國(guó)可升級(jí)膜片鉗技術(shù)

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