investigator雙光子顯微鏡成像視野是多少

細(xì)胞內(nèi)鈣離子作為重要的信號(hào)分子其作用具有時(shí)間性和空間性。當(dāng)個(gè)細(xì)胞興奮時(shí)，產(chǎn)生了一個(gè)電沖動(dòng)，此時(shí)，細(xì)胞外的鈣離子流入該細(xì)胞內(nèi)，促使該細(xì)胞分泌神經(jīng)遞質(zhì)，神經(jīng)遞質(zhì)與相鄰的下一級(jí)神經(jīng)細(xì)胞膜上的蛋白分子結(jié)合，促使這一級(jí)神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生新的電沖動(dòng)。以此類推，神經(jīng)信號(hào)便一級(jí)一級(jí)地傳遞下去，從而構(gòu)成復(fù)雜的信號(hào)體系，終形成學(xué)習(xí)、記憶等大腦的高級(jí)功能。在哺乳動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)中，鈣離子同樣扮演著重要的信號(hào)分子的角色。靜息狀態(tài)下大部分神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度約為50-100nM，而細(xì)胞興奮時(shí)鈣離子濃度能瞬間上升10-100倍，增加的鈣離子對(duì)于突觸囊泡胞吐釋放神經(jīng)遞質(zhì)的過(guò)程必不可少。眾所周知，只有游離鈣才具有生物學(xué)活性，而細(xì)胞質(zhì)內(nèi)鈣離子濃度由鈣離子的內(nèi)外流平衡所決定，同時(shí)也受鈣結(jié)合蛋白的影響。細(xì)胞外鈣離子內(nèi)流的方式有很多種，其中包括電壓門控鈣離子通道、離子型谷氨酰胺受體、煙堿型膽堿能受體（nAChR）和瞬時(shí)受體電位C型通道（TRPC）等。神經(jīng)元鈣成像的原理就是利用特殊的熒光染料或鈣離子指示劑將神經(jīng)元中鈣離子濃度的變化通過(guò)熒光強(qiáng)度表現(xiàn)出來(lái)，以反映神經(jīng)元活性。該方法可以同時(shí)觀察多個(gè)功能或位置相關(guān)的腦細(xì)胞。雙光子顯微鏡有哪些分類呢？investigator雙光子顯微鏡成像視野是多少

首先我們來(lái)簡(jiǎn)單介紹一下激光掃描共聚焦和雙光子這兩種當(dāng)紅的顯微成像技術(shù)。激光掃描共聚焦顯微技術(shù)，是熒光顯微成像的一種，用于激發(fā)樣品的熒光信號(hào)并對(duì)其放大成像。在激光掃描共聚焦顯微鏡中，樣品焦平面上每一時(shí)刻只有一個(gè)點(diǎn)被激發(fā)光照射，縱然焦平面外也有激發(fā)光照射，但通過(guò)探測(cè)器前的（pinhole），有焦平面上的熒光信號(hào)能被探測(cè)器接收。也就是說(shuō)，每個(gè)時(shí)刻，只有焦平面上一個(gè)點(diǎn)的信號(hào)被探測(cè)。通過(guò)點(diǎn)掃描的方式，一個(gè)個(gè)點(diǎn)的信號(hào)就可以組合出終的圖像。雙光子顯微鏡（包括多光子顯微鏡）同樣采用點(diǎn)掃描的方式得到圖像。不同的是，其采用的激發(fā)光波長(zhǎng)較長(zhǎng)，只有當(dāng)兩個(gè)（或更多）激發(fā)光光子幾乎同時(shí)轟擊熒光探針的時(shí)候才可能激發(fā)出熒光信號(hào)。所以只有在光子密度特別大的焦點(diǎn)，出才會(huì)激發(fā)出熒光。也就是說(shuō)，雙光子顯微鏡中，同樣每個(gè)時(shí)刻只有焦平面上一個(gè)點(diǎn)的信號(hào)被探測(cè)，并且連焦平面外的熒光信號(hào)也不會(huì)有。美國(guó)investigator雙光子顯微鏡授權(quán)商雙光子顯微鏡為什么穿透能力強(qiáng)?

在高光子密度的情況下，熒光分子可以同時(shí)吸收兩個(gè)長(zhǎng)波長(zhǎng)的光子，然后發(fā)射出一個(gè)波長(zhǎng)較短的光子，其效果和使用一個(gè)波長(zhǎng)為長(zhǎng)波長(zhǎng)一半的光子去激發(fā)熒光分子是相同的如煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH），在單光子激發(fā)時(shí)，在波長(zhǎng)為350 nm光的激發(fā)下發(fā)出450 nm熒光；而在雙光子激發(fā)時(shí)，可采用700 nm的激發(fā)光得到450 nm熒光。由于雙光子激發(fā)需要很高的光子密度，為了不損傷細(xì)胞，雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖激光器。這種激光器發(fā)出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量，從而可以減少光漂白和光毒性帶來(lái)的不利影響。

雙光子顯微鏡的優(yōu)勢(shì)相比普通的顯微鏡電子顯微鏡可以觀察尺度更小的東西，冷凍電鏡更是可以觀察有活性的生物大分子，而雙光子顯微鏡有什么優(yōu)勢(shì)呢？它能做到什么普通光學(xué)顯微鏡做不到的事情嗎？原來(lái)，雙光子顯微鏡可以精確穿透較厚標(biāo)本進(jìn)行定點(diǎn)、觀察！由于電磁波的波長(zhǎng)越短，粒子性越強(qiáng)，受散射影響也就越大。雙光子顯微鏡將激發(fā)光源改為長(zhǎng)波長(zhǎng)激光，在增加了激光的穿透性的同時(shí)還減少了對(duì)細(xì)胞的毒性。除此之外，因?yàn)橹挥形镧R焦點(diǎn)處能發(fā)生雙光子激發(fā)效應(yīng)，所以掃描的精確度極高，也能提高激發(fā)光效率，減少被掃描點(diǎn)之外的熒光物質(zhì)消耗。雙光子顯微鏡使用的是可見(jiàn)光或近紅外光作為光源；

隨著技術(shù)的發(fā)展，雙光子顯微鏡的性能得到不斷地優(yōu)化，結(jié)合它的特點(diǎn)，大致可以分成深和活兩個(gè)方面的提升。深要想讓激發(fā)激光進(jìn)入更深的層面，大致可從兩個(gè)方面入手，裝置優(yōu)化與標(biāo)本改造。關(guān)于裝置優(yōu)化，我們可以把激光束變得更細(xì)，使能量更加集中，就能讓激光穿透更深。關(guān)于標(biāo)本，其中影響光傳播的主要是物質(zhì)吸收和散射，解決這個(gè)問(wèn)題，我們需要對(duì)樣本進(jìn)行透明化處理。一種方法是運(yùn)用某種物質(zhì)將標(biāo)本浸泡，使其中的物質(zhì)（主要是脂質(zhì)）被破壞或溶解。另一種方法是運(yùn)用電泳將脂質(zhì)電解，讓標(biāo)本“透明度”提高。高光子密度帶來(lái)的高能量容易損傷細(xì)胞，所以雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖激光器。這種激光器發(fā)出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量，其脈沖達(dá)到最大值所持續(xù)的周期只有十萬(wàn)億分之一秒，而其頻率可以達(dá)到80至100兆赫，這樣即能達(dá)到雙光子激發(fā)的高光子密度要求，又能不損傷細(xì)胞，使掃描能更好地進(jìn)行。雙光子顯微鏡可以在小鼠的的任何部位進(jìn)行有生命體成像。美國(guó)雙光子顯微鏡商家

雙光子顯微鏡有這么多優(yōu)點(diǎn)，那么雙光子顯微鏡有哪些應(yīng)用呢？investigator雙光子顯微鏡成像視野是多少

雙光子顯微成像技術(shù)不是什么新技術(shù)，早在20多年前就有了，目前已經(jīng)在生命科學(xué)和材料科學(xué)中廣泛應(yīng)用。幾年前雙光子過(guò)期后，已經(jīng)推出自己的雙光子顯微鏡的廠家估計(jì)不少于10家以上。即便如此，世界上很多實(shí)驗(yàn)室都搭雙光子，自己搭的好處有很多，首先是便宜，尤其是實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)有飛秒激光器，那就更很省錢了。其次是靈活，可以選擇針對(duì)特殊用途的搭配，改動(dòng)也靈活。好處就是可以鍛煉隊(duì)伍，一趟走下來(lái)可以把新手帶出來(lái)，后期維護(hù)也更加自由。當(dāng)然壞處也不少，首先是操心，特別是第1次搭的時(shí)候，開(kāi)始要想方案，后來(lái)要解決各種實(shí)際問(wèn)題。其次是花時(shí)間，加上買配件的時(shí)間，比買一臺(tái)現(xiàn)成的商業(yè)化雙光子耗時(shí)長(zhǎng)?，F(xiàn)在已經(jīng)有不少關(guān)于如何搭雙光子顯微鏡的文章，各種protocol，大多是老外寫的，中文的較少。其實(shí)完全自己搭一套好用的系統(tǒng)還是不容易的，尤其是沒(méi)有經(jīng)驗(yàn)的時(shí)候，容易走彎路，多花錢，也多花時(shí)間，再加上雙光子的重要器件都需要從國(guó)外購(gòu)買，在國(guó)內(nèi)買這些東西耗時(shí)較長(zhǎng)。因此，我想總結(jié)一下我們的經(jīng)驗(yàn)，貼出來(lái)分享，希望能幫到想自己動(dòng)手的實(shí)驗(yàn)室，investigator雙光子顯微鏡成像視野是多少