相對(duì)定量實(shí)驗(yàn)方法包括兩種重要方法：ΔΔCT Method：使用內(nèi)參基因定量所研究樣品和參照樣品的目的基因。內(nèi)參基因與目的基因可以同時(shí)反應(yīng)，也可以單獨(dú)反應(yīng)；雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法：對(duì)每個(gè)樣品的內(nèi)參基因和目的基因都做定量，求出每個(gè)樣品中內(nèi)參基因和目的基因的數(shù)量，然后根據(jù)相對(duì)定量的基本公式來(lái)求出目的基因的差異表達(dá)。定量需要由標(biāo)準(zhǔn)曲線建立Ct值跟拷貝數(shù)之間的關(guān)系，標(biāo)準(zhǔn)曲線由標(biāo)準(zhǔn)品生成，標(biāo)準(zhǔn)品可以是已知濃度的RNA、質(zhì)?；蚝铣傻墓押塑账徭溕桑课粗０鍟r(shí)標(biāo)準(zhǔn)樣品和未知樣品必須同時(shí)反應(yīng)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR指在PCR反應(yīng)體系加入熒光基團(tuán)，熒光信號(hào)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)PCR,通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析.珠?？焖賟PCR儀設(shè)置
PCR：Polymerase chain reaction. 是體外模擬生物的DNA 復(fù)制。需要DNA 聚合酶，DNA 模板，兩端引物，脫氧核苷酸dNTPs( dATP, ACTP, dGTP, dTTP),以及適當(dāng)?shù)木彌_體系。PCR 產(chǎn)物的增長(zhǎng)形式為２N (如果各種試劑和外部所加條件均理想化，N 是循環(huán)數(shù))。實(shí)際中，擴(kuò)增效率不為100％。Real time PCR 是定量PCR 的一種，當(dāng)然是在PCR 的基礎(chǔ)上發(fā)展出來(lái)的。（普通）PCR 包含很多因素，屬性，如：試劑，溫度，循環(huán)數(shù)，程序，PCR 產(chǎn)物（擴(kuò)增子，amplicon）的量，擴(kuò)增曲線（擴(kuò)增子累積曲線），摻錯(cuò)率，擴(kuò)增子長(zhǎng)度。一般來(lái)說(shuō)，人們關(guān)心的是擴(kuò)增子的量。而real time PCR 主要利用的是擴(kuò)增曲線（amplification curve）, 循環(huán)數(shù)；擴(kuò)增子長(zhǎng)度，擴(kuò)增效率，擴(kuò)增子多少，也加以考慮。珠?？焖賟PCR儀設(shè)置TaqMan方法通過(guò)采用熒光探針在PCR循環(huán)過(guò)程中隨著特定PCR產(chǎn)物的累計(jì)而對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)。
原理：在DNA擴(kuò)增反應(yīng)中，通過(guò)熒光化學(xué)物質(zhì)測(cè)定每次PCR循環(huán)后產(chǎn)物總量。目的：實(shí)現(xiàn)定量而不止是定性分析。通過(guò)與內(nèi)參基因進(jìn)行對(duì)比，對(duì)樣品中的特定基因進(jìn)行相對(duì)表達(dá)量的計(jì)算，以實(shí)現(xiàn)定量分析。qPCR的檢測(cè)方法有兩種，SYBRGreenl法和TaqMan探針?lè)?，下面介紹常用的SYBRGreenl法。原理：在PCR反應(yīng)體系中，加入過(guò)量SYBR熒光染料，使其特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后，發(fā)射熒光信號(hào)，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會(huì)發(fā)射任何熒光信號(hào)，從而保證熒光信號(hào)的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。試劑及儀器：Hieff®QpcrSYBR®GreenMasterMix試劑(翌圣)和ABI7500Real-TimeSystem實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增。
雙雜交探針是兩個(gè)特異性探針，一個(gè)只5’端標(biāo)記熒光基團(tuán)，另一個(gè)只3’端標(biāo)記猝滅基團(tuán)。這兩個(gè)探針序列和模板特異性結(jié)合，結(jié)合的位置非常鄰近。在qPCR反應(yīng)的退火階段，當(dāng)兩個(gè)探針與模板結(jié)合時(shí)，位于兩個(gè)探針頭尾的熒光基團(tuán)之間產(chǎn)生FRET現(xiàn)象，促進(jìn)受體的熒光基團(tuán)釋放一種波長(zhǎng)的熒光信號(hào)，從而達(dá)到實(shí)時(shí)監(jiān)控反應(yīng)進(jìn)程的目的。Amplifluor系統(tǒng)包括兩個(gè)特異性引物和一條檢測(cè)探針（UniPrimer），其中一條引物的5’末端帶有部分序列和UniPrimer的3’末端部分序列相同。UniPrimer兩端分別被熒光和淬滅基團(tuán)標(biāo)記且有發(fā)卡結(jié)構(gòu)。反應(yīng)時(shí)，UniPrimer結(jié)合到特異性引物擴(kuò)增出的模板上作為引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，在延伸的過(guò)程中UniPrimer發(fā)夾結(jié)構(gòu)打開，熒光信號(hào)釋放。蝎形引物為莖環(huán)結(jié)構(gòu)，其5’端帶有一個(gè)熒光基團(tuán)FAM，3’端帶有一個(gè)淬滅基團(tuán)DABCYL，其環(huán)的部分序列和模板完全互補(bǔ)配對(duì)。體系有模板時(shí)，莖環(huán)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，熒光和淬滅基團(tuán)相距近，不能檢出熒光信號(hào)；體系無(wú)模板時(shí)，蝎形引物和模板特異性結(jié)合并起始PCR擴(kuò)增，蝎形引物的環(huán)結(jié)構(gòu)與擴(kuò)增出的模板互補(bǔ)雜交，導(dǎo)致莖環(huán)結(jié)構(gòu)被破壞，釋放出大量的熒光信號(hào)，熒光儀器可以實(shí)時(shí)收集這些熒光信號(hào)并生成相應(yīng)的熒光擴(kuò)增曲線。dPCR比qPCR準(zhǔn)確度與精密度高。
交聯(lián)和裂解——穩(wěn)定復(fù)合物并分離核組分:第一步對(duì)時(shí)間要求嚴(yán)格并且需要優(yōu)化。體內(nèi)共價(jià)交聯(lián)穩(wěn)定蛋白質(zhì)-DNA相互作用并于特定時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行分析。通常采用甲醛交聯(lián)，加入甘氨酸以終止反應(yīng)。交聯(lián)劑滲透到完整細(xì)胞中并將蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物鎖定在一起從而進(jìn)行分析。交聯(lián)劑在整個(gè)過(guò)程中保持復(fù)合物穩(wěn)定，但其作用必須是可逆的才能用于ChIP。一些非常穩(wěn)定的蛋白質(zhì)-DNA相互作用則不需要交聯(lián)。接下來(lái)，使用裂解液透化細(xì)胞膜，釋放細(xì)胞組分，然后蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物變得可溶。去除細(xì)胞溶質(zhì)蛋白以減少背景信號(hào)并增加靈敏度。注意：此時(shí)可以停止ChIP測(cè)定。 經(jīng)過(guò)交聯(lián)，淬滅和洗滌細(xì)胞沉淀后，將裂解物于-80℃儲(chǔ)存。自聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)被發(fā)明以來(lái)，其簡(jiǎn)單、可靠、快速、靈敏的質(zhì)量，PCR是分子生物學(xué)中使用的技術(shù)。深圳酷博qPCR儀應(yīng)用
Quantagene q225 系列熒光定量PCR 系統(tǒng)：快速 分秒必爭(zhēng)，43 分鐘完成40 循環(huán)qPCR 實(shí)驗(yàn)。珠海快速qPCR儀設(shè)置
TaqMan 方法的優(yōu)點(diǎn)：需要在探針和目標(biāo)分子（靶點(diǎn)）之間發(fā)生特異性的水解（雜交），方可生成熒光信號(hào)?？墒褂妹黠@不同的報(bào)告基因染料標(biāo)記探針，在一個(gè)反應(yīng)管內(nèi)擴(kuò)增并檢測(cè)兩個(gè)不同的序列。無(wú)需PCR后處理，減少分析工作量并節(jié)省材料成本。TaqMan方法的缺點(diǎn)：TaqMan方法的主要缺點(diǎn)在于需要根據(jù)不同的序列，合成不同的探針。SYBR Green I染料試劑。一般將可與雙鏈DNA發(fā)生結(jié)合的小分子分為以下兩類：嵌入劑、小溝結(jié)合物。無(wú)論哪種結(jié)合方法，用于PCR實(shí)時(shí)檢測(cè)的DNA結(jié)合染料都需要滿足以下兩個(gè)條件：結(jié)合至雙鏈DNA時(shí)，會(huì)有增強(qiáng)的熒光對(duì) PCR 不會(huì)產(chǎn)生抑制我們開發(fā)更加優(yōu)化的條件，使得SYBR Green I染料的使用不會(huì)對(duì)PCR產(chǎn)生抑制并帶來(lái)相對(duì)于溴化乙錠更為靈敏的檢測(cè)。珠?？焖賟PCR儀設(shè)置
廣州雙螺旋科學(xué)儀器有限公司致力于精細(xì)化學(xué)品，是一家服務(wù)型公司。公司業(yè)務(wù)分為數(shù)字PCR，純水機(jī)，病理切片機(jī)，倍性分析儀等，目前不斷進(jìn)行創(chuàng)新和服務(wù)改進(jìn)，為客戶提供良好的產(chǎn)品和服務(wù)。公司將不斷增強(qiáng)企業(yè)重點(diǎn)競(jìng)爭(zhēng)力，努力學(xué)習(xí)行業(yè)知識(shí)，遵守行業(yè)規(guī)范，植根于精細(xì)化學(xué)品行業(yè)的發(fā)展。雙螺旋科學(xué)儀器憑借創(chuàng)新的產(chǎn)品、專業(yè)的服務(wù)、眾多的成功案例積累起來(lái)的聲譽(yù)和口碑，讓企業(yè)發(fā)展再上新高。