實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real-time fluorescence quantitative PCR，qPCR）通過(guò)在普通 PCR 反應(yīng)體系中加入了熒光標(biāo)記探針或熒光染料，利用熒光信號(hào)的變化實(shí)時(shí)檢測(cè)PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物變化。通過(guò)熒光強(qiáng)度變化監(jiān)測(cè)產(chǎn)物量的變化，從而得到一條熒光擴(kuò)增曲線圖。具有專一性更高、可實(shí)時(shí)監(jiān)控、可重復(fù)精確定量等優(yōu)勢(shì)。qPCR的種類根據(jù)qPCR的化學(xué)發(fā)光原理一般分為2大類：一類是探針?lè)?，利用與靶序列特異雜交的探針來(lái)指示擴(kuò)增產(chǎn)物的增加；一類是基于SYBR Green I 的染料法，通過(guò)熒光染料來(lái)指示產(chǎn)物的增加。qPCR實(shí)現(xiàn)了通過(guò)Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線的分析對(duì)起始模板進(jìn)行定量分析。湛江qPCR儀消毒
交聯(lián)和裂解——穩(wěn)定復(fù)合物并分離核組分:第一步對(duì)時(shí)間要求嚴(yán)格并且需要優(yōu)化。體內(nèi)共價(jià)交聯(lián)穩(wěn)定蛋白質(zhì)-DNA相互作用并于特定時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行分析。通常采用甲醛交聯(lián)，加入甘氨酸以終止反應(yīng)。交聯(lián)劑滲透到完整細(xì)胞中并將蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物鎖定在一起從而進(jìn)行分析。交聯(lián)劑在整個(gè)過(guò)程中保持復(fù)合物穩(wěn)定，但其作用必須是可逆的才能用于ChIP。一些非常穩(wěn)定的蛋白質(zhì)-DNA相互作用則不需要交聯(lián)。接下來(lái)，使用裂解液透化細(xì)胞膜，釋放細(xì)胞組分，然后蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物變得可溶。去除細(xì)胞溶質(zhì)蛋白以減少背景信號(hào)并增加靈敏度。注意：此時(shí)可以停止ChIP測(cè)定。 經(jīng)過(guò)交聯(lián)，淬滅和洗滌細(xì)胞沉淀后，將裂解物于-80℃儲(chǔ)存。華南地區(qū)高效qPCR儀使用說(shuō)明qPCR面對(duì)小的差異較弱，dPCR則可識(shí)別差異較小的拷貝數(shù)。
染色質(zhì)片段化——DN段化:細(xì)胞核材料片段化是獲得良好的ChIP 分辨率的關(guān)鍵因素，理想情況下的片段大小在 200 到 800 bp對(duì)之間。剪切是難控制的步驟之一。通過(guò)超聲處理和/或核酸酶/酶促消化可以實(shí)現(xiàn)剪切，各有利弊。超聲處理需要大量的手動(dòng)操作時(shí)間，但非常適合難以裂解的細(xì)胞；酶促消化不需要手動(dòng)操作，適用于大量樣品的處理，但其剪切位點(diǎn)不是隨機(jī)的。兩種方法都需要根據(jù)具體細(xì)胞系進(jìn)行優(yōu)化。注意：此時(shí)可以停止ChIP。經(jīng)過(guò)剪切/消化染色質(zhì)后，可以將樣品于-80°C儲(chǔ)存。避免反復(fù)凍融。
免疫沉淀——捕獲并分離蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物使用抗體捕獲蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物中的目標(biāo)蛋白質(zhì)是實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵因素?？贵w免疫沉淀并從細(xì)胞核組分中分離蛋白質(zhì)，去除不相關(guān)的細(xì)胞物質(zhì)。使用抗體結(jié)合磁珠完成所得抗體-蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物的純化。經(jīng)過(guò)孵育后，充分洗滌磁珠-抗體-蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物，純化并洗脫蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物。制備DNA——解交聯(lián)和DNA純化:現(xiàn)在含有目標(biāo)蛋白質(zhì)的染色質(zhì)片段已分離，需要解交聯(lián)并純化DNA。解交聯(lián)通常采用高熱孵育和/或消化來(lái)完成。注意：此時(shí)可以停止ChIP。經(jīng)過(guò)解交聯(lián)和/或DNA純化后，可以將樣品于-20°C儲(chǔ)存。Taqman探針?lè)ㄒ蛱禺愋愿?，被廣泛應(yīng)用于等位基因鑒別、SNP分型、病原體和病毒檢測(cè)、多重定量等。
常規(guī)PCR中，PCR產(chǎn)物通過(guò)凝膠電泳，然后進(jìn)行成像分析，常規(guī)PCR只能通過(guò)終點(diǎn)法對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行定性分析，而不能進(jìn)行定量分析；熒光定量PCR中，PCR反應(yīng)體系中加入了熒光分子，通過(guò)熒光信號(hào)的變化來(lái)反應(yīng)擴(kuò)增產(chǎn)物的變化，使PCR產(chǎn)物的實(shí)時(shí)檢測(cè)成為可能。相對(duì)常規(guī)PCR而言，熒光定量PCR的主要優(yōu)點(diǎn)是準(zhǔn)確地確定初始模版拷貝數(shù)和較高的檢測(cè)靈敏度；熒光定量PCR不僅可用于定性，如判斷一段序列的有無(wú)，也可用于定量，如確定起始模版的拷貝數(shù)；常規(guī)PCR的定量方法，測(cè)定的都是PCR的終產(chǎn)物，而不是起始DNA拷貝數(shù)。而從圖中可以看出，雖然相同模版在同一臺(tái)PCR儀上進(jìn)行96次擴(kuò)增，終點(diǎn)處檢測(cè)產(chǎn)物量不恒定，但96次PCR擴(kuò)增曲線都有一個(gè)共同的拐點(diǎn)，即熒光定量PCR中Ct值的重現(xiàn)性，恒定的Ct值為熒光定量PCR的分析提供了理論依據(jù)。q225 加樣孔板側(cè)壁和金屬熱塊能夠嚴(yán)密貼合，使液體樣品迅速達(dá)到設(shè)定溫度，從而減少實(shí)驗(yàn)時(shí)間。湛江qPCR儀消毒
qpcr在擴(kuò)增每個(gè)循環(huán)中模板DNA通過(guò)變性、復(fù)性、延伸三個(gè)階段形成更多的子代DNA，為下一個(gè)循環(huán)提供模板DNA。湛江qPCR儀消毒
實(shí)時(shí)熒光定量PCR所使用的熒光物質(zhì)可分為兩種：熒光探針和熒光染料。現(xiàn)將其原理簡(jiǎn)述如下：1. TaqMan熒光探針：PCR擴(kuò)增時(shí)在加入一對(duì)引物的同時(shí)加入一個(gè)特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)和一個(gè)淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收；PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶的5'－3'外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。2. SYBR熒光染料：在PCR反應(yīng)體系中，加入過(guò)量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料非特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后，發(fā)射熒光信號(hào)，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會(huì)發(fā)射任何熒光信號(hào)，從而保證熒光信號(hào)的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。SYBR與雙鏈DNA進(jìn)行結(jié)合，因此可以通過(guò)溶解曲線，確定PCR反應(yīng)是否特異。3.分子信標(biāo)：是一種在5和3末端自身形成一個(gè)8個(gè)堿基左右的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的莖環(huán)雙標(biāo)記寡核苷酸探針，兩端的核酸序列互補(bǔ)配對(duì)，導(dǎo)致熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)緊緊靠近，不會(huì)產(chǎn)生熒光。PCR產(chǎn)物生成后，退火過(guò)程中，分子信標(biāo)中間部分與特定DNA序列配對(duì)，熒光基因與淬滅基因分離產(chǎn)生熒光。湛江qPCR儀消毒
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