qpcr的檢測原理：qPCR主要是使用插入染料或熒光探針(例如TaqMan)，利用實時積累的熒光信號監(jiān)測整個擴(kuò)增過程，然后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線來對未知模板進(jìn)行定量分析。qPCR 主要是依賴于標(biāo)準(zhǔn)品制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)而去確定未知樣品的濃度，因此是一種相對定量的方法。隨著PCR的循環(huán)進(jìn)行，染料熒光強(qiáng)度增加，從而檢測到定量反應(yīng)的DNA。SYBR Green是一種DNA插入染料，范圍廣用于qPCR。雖然SYBR Green方法比探針方法便宜，但是特異性沒有熒光探針方法好。q225 加樣孔板側(cè)壁和金屬熱塊能夠嚴(yán)密貼合，使液體樣品迅速達(dá)到設(shè)定溫度，從而減少實驗時間。廣東Quantagene q225mxqPCR儀儀器
與標(biāo)準(zhǔn) PCR 一樣，SYBR Green 方案由變性、退火和延伸階段組成。 不同之處在于，您在 qPCR 設(shè)置期間將一些雙鏈 DNA 結(jié)合染料 SYBR Green I 添加到預(yù)混液中。 這種熒光染料在延伸階段嵌入到雙鏈 DNA 序列中，顯示出熒光信號的強(qiáng)烈增加。 在每個熱循環(huán)結(jié)束時測量此信號將使您能夠確定存在的雙鏈 DNA 的數(shù)量。SYBR Green 檢測的缺點是染料會與任何雙鏈 DNA 序列結(jié)合。 這意味著您還可以檢測非特異性 qPCR 產(chǎn)物（例如引物二聚體）發(fā)出的熒光。 為消除這種風(fēng)險，通過執(zhí)行熔解曲線分析檢查反應(yīng)特異性，或使用 TaqMan 方法。深圳小巧qPCR儀消毒SYBR Green是一種DNA插入染料用于qPCR。雖然SYBR Green方法比探針方法便宜，但是特異性沒有熒光探針方法好。
染色質(zhì)片段化——DN段化:細(xì)胞核材料片段化是獲得良好的ChIP 分辨率的關(guān)鍵因素，理想情況下的片段大小在 200 到 800 bp對之間。剪切是難控制的步驟之一。通過超聲處理和/或核酸酶/酶促消化可以實現(xiàn)剪切，各有利弊。超聲處理需要大量的手動操作時間，但非常適合難以裂解的細(xì)胞；酶促消化不需要手動操作，適用于大量樣品的處理，但其剪切位點不是隨機(jī)的。兩種方法都需要根據(jù)具體細(xì)胞系進(jìn)行優(yōu)化。注意：此時可以停止ChIP。經(jīng)過剪切/消化染色質(zhì)后，可以將樣品于-80°C儲存。避免反復(fù)凍融。
實時熒光定量PCR所使用的熒光物質(zhì)可分為兩種：熒光探針和熒光染料?，F(xiàn)將其原理簡述如下：1. TaqMan熒光探針：PCR擴(kuò)增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個報告熒光基團(tuán)和一個淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時，報告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號被淬滅基團(tuán)吸收；PCR擴(kuò)增時，Taq酶的5'－3'外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。2. SYBR熒光染料：在PCR反應(yīng)體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料非特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后，發(fā)射熒光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發(fā)射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。SYBR與雙鏈DNA進(jìn)行結(jié)合，因此可以通過溶解曲線，確定PCR反應(yīng)是否特異。3.分子信標(biāo)：是一種在5和3末端自身形成一個8個堿基左右的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的莖環(huán)雙標(biāo)記寡核苷酸探針，兩端的核酸序列互補(bǔ)配對，導(dǎo)致熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)緊緊靠近，不會產(chǎn)生熒光。PCR產(chǎn)物生成后，退火過程中，分子信標(biāo)中間部分與特定DNA序列配對，熒光基因與淬滅基因分離產(chǎn)生熒光。qPCR 反應(yīng)所需時間取決于反應(yīng)溶液進(jìn)行變溫所需要的時間，這過程受到加熱塊升降溫速度和液體升降溫速度影響。
Quantagene q225 系列熒光定量PCR 系統(tǒng)主要特點：精確定量 以可靠的數(shù)據(jù)助力您的研究。采用擬合算法計算 Ct 值，定量誤差不超過±10%。液體冷卻循環(huán)系統(tǒng)確保孔間溫度高度一致，溫差不超過 ±0.15°C。光學(xué)系統(tǒng)無運動部件，穩(wěn)定性增加，長期使用無需校準(zhǔn)與維護(hù)。的儀器間重復(fù)性，不同位置、不同反應(yīng)體積均不影響定量結(jié)果。快速高效 用更短的時間獲得更多數(shù)據(jù)。40 個循環(huán)的常規(guī) qPCR 只需43 分鐘，較常見qPCR 儀多縮短60% 的時間。在提高速度的同時保持了96 孔的高通量，滿足絕大多數(shù)實驗需求。小巧輕便 節(jié)省空間及您的寶貴樣品小體積為移動實驗和大量部署提供可能。5-10 μl 的推薦反應(yīng)體積，較常規(guī)實驗節(jié)省80%的試劑用量，更節(jié)約您的珍貴樣品。PCR反應(yīng)需要五種關(guān)鍵試劑：PCR模板、DNA聚合酶、引物、脫氧核苷酸三磷酸（dNTPs）、PCR緩沖液。廣東Quantagene q225mxqPCR儀儀器
與標(biāo)準(zhǔn) PCR 一樣，SYBR Green 方案由變性、退火和延伸階段組成。廣東Quantagene q225mxqPCR儀儀器
實時熒光定量PCR（Real-time fluorescence quantitative PCR，qPCR）通過在普通 PCR 反應(yīng)體系中加入了熒光標(biāo)記探針或熒光染料，利用熒光信號的變化實時檢測PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物變化。通過熒光強(qiáng)度變化監(jiān)測產(chǎn)物量的變化，從而得到一條熒光擴(kuò)增曲線圖。具有專一性更高、可實時監(jiān)控、可重復(fù)精確定量等優(yōu)勢。qPCR的種類根據(jù)qPCR的化學(xué)發(fā)光原理一般分為2大類：一類是探針法，利用與靶序列特異雜交的探針來指示擴(kuò)增產(chǎn)物的增加；一類是基于SYBR Green I 的染料法，通過熒光染料來指示產(chǎn)物的增加。廣東Quantagene q225mxqPCR儀儀器
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