現(xiàn)有dPCR分析方法采用熒光探針和基于光的檢測方法來鑒定擴增產(chǎn)物。這些方法要求足夠的靶分子擴增以產(chǎn)生足以被檢測到的信號，但可能會導致額外的錯誤或偏差，因此，希望能夠提供一種改進的、用于檢測樣品內(nèi)感興趣的核酸的方法，其采用替代性分析方法，具有提高的準確度和精確度，并且其具有可以與基于dPCR的方法關(guān)聯(lián)使用的靈敏度。dPCR還在樣品內(nèi)進行單一反應，但是所述樣品被分離成大量的分區(qū)(partition)，并且所述反應在每個分區(qū)中單獨進行。這種分離允許對核酸量進行靈敏的測量。DPCR已被證明可有效用于研究基因序列中的變異，例如拷貝數(shù)變異或點突變。dPCR被稱作第三代PCR技術(shù)，但dPCR技術(shù)的廣泛應用逐漸顯現(xiàn)出一些不足之處。美國進口數(shù)字PCR系統(tǒng)
作為時下的熱點技術(shù)，數(shù)字PCR是將核酸樣品分配到大量單獨、平行的微反應單元（nL，納升級別）中，使得每個反應單元中盡可能含有1個模板分子，并在此基礎(chǔ)上進行擴增、檢測和分布統(tǒng)計，從而實現(xiàn)靶標分子的比較 計數(shù)。（圖：數(shù)字PCR技術(shù)原理）根據(jù)微反應單元的不同形式，數(shù)字PCR產(chǎn)品可分為微板式、微滴式和芯片式等。目前，市場上主要的數(shù)字PCR產(chǎn)品主要是基于微滴式和芯片式，如Bio-Rad公司的QX200微滴式系統(tǒng)和ThermoFisher公司的QuantStudio系統(tǒng)等。與一、二代PCR技術(shù)相比，數(shù)字PCR具有很多優(yōu)勢：一是特異性、靈敏性均有顯著提高；二是在不依賴內(nèi)參和標準曲線的前提下，可直接得到比較 量化指標；三是微反應單元相互獨立、封閉，避免了PCR抑制劑及不同核酸分子擴增產(chǎn)物間的相互干擾，準確度和可重復性較高。數(shù)字PCR性能特點PCR本質(zhì)上是將一個傳統(tǒng)的PCR反應分成了數(shù)萬個PCR反應。
微滴數(shù)字PCR主要是將兩種互不相溶的液體，以其中一種作為連續(xù)相（油），另一種作為分散相（水），在水/油兩相表面張力和剪切共同作用下分散相以微小體積單元的形式存在于連續(xù)中，從而成液滴。這種液滴式的反應腔室具有體積小、樣品間無擴散等優(yōu)勢。在ddPCR中，利用微滴發(fā)生器可以一次生成數(shù)萬乃至百萬個納升甚至皮升級別的單個油包水微滴，作為數(shù)字PCR的樣品分散載體。這里，液滴中包裹了單拷貝DNA模板和PCR反應液，然后將液滴收集在PCR反應管中進行擴增。?PCR反應結(jié)束后檢測每個微滴的熒光信號。目前Bio-Rad公司的QX100系統(tǒng)、QX200系統(tǒng)均為采用液滴技術(shù)的數(shù)字PCR系統(tǒng)。圖6.Bio-Rad的液滴數(shù)字PCR系統(tǒng)
在PCR進行的過程中，首先是引物和探針分別結(jié)合，然后開始擴增。如果一個微滴當中有目標基因的片段，Taqman探針就會被酶切碎，熒光基團和淬滅基團分離。在后面的檢測過程中，熒光基團被激發(fā)光路激發(fā)之后就會發(fā)熒光。如果沒有，Taqman探針就不會被切碎，在后面的檢測過程中，熒光基團吸收到激發(fā)光的能量，就會被淬滅基團給淬滅，那么儀器就檢測不到這個微滴的信號。檢測的過程中，并不是說一個樣本中檢測到了幾個亮點，這個反應當中就有幾個目標基因的拷貝。因為目標基因的片段，在微滴當中的分布，是符合泊松分布的（也就是說進不進的概率相等，并且相互獨立）。所以，一個發(fā)光的微滴中，可能有一個或者三個四個，甚至更多個目標基因的拷貝。因此，發(fā)光的微滴數(shù)與原始的基因拷貝數(shù)并不是一對一的對應關(guān)系。楊雁峰博士堅信數(shù)字PCR是可以應用于無創(chuàng)產(chǎn)前篩查的理想技術(shù)之一，這也是他2016年創(chuàng)立塔歌生物的初衷。
naica®六通道微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)，源于crystal微滴芯片數(shù)字PCR技術(shù)，自動化微滴生成和擴增，每個樣本孔可實現(xiàn)6熒光通道的檢測，智能化識別微滴并進行質(zhì)控，3小時內(nèi)即可獲得至少6個靶標基因的一定程度上拷貝數(shù)濃度，融合傳統(tǒng)微滴式和芯片式優(yōu)勢，被稱為下一代數(shù)字PCR技術(shù)。只需一步移液操作，將PCR反應液加載于創(chuàng)新型微流控芯片，naica®六通道微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)即可自動生成單層平鋪的2D微滴陣列，隨后對每個微滴進行溫度均勻一致的PCR擴增后，進行六通道熒光信號采集，計數(shù)陰陽性微滴，通過泊松分布計算獲得靶標基因一定程度上拷貝數(shù)濃度。影響dPCR定量結(jié)果的因素：儀器采用的分散方式與數(shù)量、溶液稀釋方法、分散體積的準確性以及結(jié)果表達方式。廣州進口數(shù)字PCR樣品回收
dPCR的結(jié)果統(tǒng)計方式有2種，一種是采用標記多種顏色，另一種采用概率統(tǒng)計的數(shù)據(jù)處理方法。美國進口數(shù)字PCR系統(tǒng)
數(shù)字PCR產(chǎn)品的發(fā)展，為不同場景下的多樣化核酸檢測需求提供了新的思路，尤其是在醫(yī)學檢驗方面，在 性疾病早期檢測、病癥的液體活檢、無創(chuàng)產(chǎn)前檢查等領(lǐng)域展現(xiàn)出良好的應用前景。實現(xiàn) 性疾病早期高效檢測——以病毒為例，有病毒檢測、和臨床樣本病毒載量評估He監(jiān)測環(huán)境病毒載量；二代熒光定量PCR檢測技術(shù)是目前病毒檢測的"金標準"，但由于病毒探針結(jié)合位點突變、樣本病毒載量不足等原因，在臨床檢測過程中經(jīng)常出現(xiàn)假陰性結(jié)果，由于數(shù)字PCR具有更高的靈敏度、精細度，以及其適合痕量樣本檢測的特性，能夠檢測出熒光定量PCR檢測過程中錯過的 ，可作為后者的補充。在人群篩查及臨床診療中，為科學選取采樣方式，需要評估不同臨床樣本病毒載量，如鼻咽拭子、血尿、糞便、肺泡灌洗液等，由于數(shù)字PCR可提供一定程度上量化指標，為采樣方法的選取提供了參考，從而提高檢出率。在外防輸入的戰(zhàn)略要求下，環(huán)境病毒檢測工作尤為重要，數(shù)字PCR可對低核酸豐度樣本進行有效檢測，包括從不同環(huán)境中取樣的樣本，如病房、醫(yī)院衛(wèi)生間、實驗室等等，在病情防控中起到了不可忽視的作用。此外，數(shù)字PCR的應用場景還有病程不同階段的病毒載量評估、核酸參考品制備、抗病毒藥物研發(fā)等環(huán)節(jié)。美國進口數(shù)字PCR系統(tǒng)
廣州雙螺旋科學儀器有限公司是以提供數(shù)字PCR，純水機，病理切片機，倍性分析儀為主的有限責任公司（自然），雙螺旋科學儀器是我國精細化學品技術(shù)的研究和標準制定的重要參與者和貢獻者。雙螺旋科學儀器以數(shù)字PCR，純水機，病理切片機，倍性分析儀為主業(yè)，服務于精細化學品等領(lǐng)域，為全國客戶提供先進數(shù)字PCR，純水機，病理切片機，倍性分析儀。多年來，已經(jīng)為我國精細化學品行業(yè)生產(chǎn)、經(jīng)濟等的發(fā)展做出了重要貢獻。