在定量PCR時(shí)，我們常常糾結(jié)一個(gè)問(wèn)題，究竟是相對(duì)定量還是***定量呢？如今，你無(wú)需糾結(jié)了，因?yàn)閿?shù)字PCR（digitalPCR）來(lái)了。盡管這兩種技術(shù)有些類似，都是估計(jì)起始樣品中的核酸量，但它們有一個(gè)重要的區(qū)別。定量PCR是依靠標(biāo)準(zhǔn)曲線或參照基因來(lái)測(cè)定核酸量，而數(shù)字PCR則讓你能夠直接數(shù)出DNA分子的個(gè)數(shù)，是對(duì)起始樣品的***定量。因此特別適用于依靠Ct值不能很好分辨的應(yīng)用領(lǐng)域：拷貝數(shù)變異、突變檢測(cè)、基因相對(duì)表達(dá)研究（如等位基因不平衡表達(dá)）、二代測(cè)序結(jié)果驗(yàn)證、miRNA表達(dá)分析、單細(xì)胞基因表達(dá)分析等。影響dPCR定量結(jié)果的因素：儀器采用的分散方式與數(shù)量、溶液稀釋方法、分散體積的準(zhǔn)確性以及結(jié)果表達(dá)方式。法國(guó)醫(yī)療系統(tǒng)認(rèn)證數(shù)字PCR技術(shù)
數(shù)字聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（digitalpolymerchainreaction，dPCR）技術(shù)因具有高靈敏度、受基質(zhì)干擾少等優(yōu)勢(shì)而被廣用于轉(zhuǎn)基因食品檢測(cè)。本研究綜述了數(shù)字PCR技術(shù)的原理、系統(tǒng)各部件的優(yōu)劣勢(shì)，梳理了數(shù)字PCR技術(shù)在轉(zhuǎn)基因檢測(cè)與溯源技術(shù)（標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)）方面的進(jìn)展和發(fā)展趨勢(shì)，以期為轉(zhuǎn)基因食品檢測(cè)領(lǐng)域提供參考依據(jù)。dPCR的擴(kuò)增過(guò)程大致上可以分為3步：樣品的分散、樣品的熱循環(huán)擴(kuò)增和樣品的檢測(cè)。對(duì)于數(shù)字PCR儀器系統(tǒng)，各個(gè)部件之間仍然有較大的改進(jìn)空間，要發(fā)揮部件之間的協(xié)同作用是很重要的，而且有持續(xù)研究的價(jià)值。表1中總結(jié)了部分常見(jiàn)的數(shù)字PCR系統(tǒng)的類型，以及相對(duì)在硬件、便攜性、性價(jià)比和自動(dòng)化程度上的比較。廣東數(shù)字PCR儀器數(shù)字PCR是通過(guò)將一個(gè)樣本分成幾十到幾萬(wàn)份，分配到不同的反應(yīng)單元，每個(gè)單元至少包含一個(gè)拷貝的目標(biāo)分子 。
dPCR在使用過(guò)程中需要特別注意體積誤差造成的結(jié)果偏差。體積誤差對(duì)于測(cè)量拷貝數(shù)濃度會(huì)產(chǎn)生偏差。目前dPCR中體積優(yōu)化方法以光學(xué)顯微鏡觀測(cè)為主。分散體積的差異會(huì)增加拷貝數(shù)結(jié)果的不確定性，Emslie等使用光學(xué)顯微鏡縱向拍照比較圖片邊緣的微小差異，考察了數(shù)字PCR系統(tǒng)中每個(gè)微孔內(nèi)和孔與孔間的體積差異對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響程度。Corbisier等使用微滴數(shù)字PCR對(duì)6種不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)棉籽粉質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)[ERM-AD623a-f，濃度范圍（10~10）copies/ul]進(jìn)行分析，優(yōu)化了液滴體積得到相應(yīng)校正因子，并使用該校正因子發(fā)現(xiàn)并校準(zhǔn)了運(yùn)行軟件中液滴體積不變的假設(shè)而引起的數(shù)據(jù)偏離，數(shù)據(jù)結(jié)果的一致性有明顯提高。
目前dPCR主要有兩種形式，芯片式和液滴式，但基本原理都是將大量稀釋后的核酸溶液分散至芯片的微反應(yīng)器或微滴中，每個(gè)反應(yīng)器的核酸模板數(shù)少于或者等于1個(gè)。這樣經(jīng)過(guò)PCR循環(huán)之后，有一個(gè)核酸分子模板的反應(yīng)器就會(huì)給出熒光信號(hào)，沒(méi)有模板的反應(yīng)器就沒(méi)有熒光信號(hào)。根據(jù)相對(duì)比例和反應(yīng)器的體積，就可以推算出原始溶液的核酸濃度?？梢允褂脦追N不同的方法來(lái)分配樣品，包括微孔板，毛細(xì)管，油乳劑和帶有核酸結(jié)合表面的小型化腔室陣列。樣品的分配使人們可以通過(guò)假設(shè)分子種群遵循泊松分布來(lái)估計(jì)不同分子的數(shù)量，根據(jù)泊松分布的原理，反應(yīng)體系中目標(biāo)分子的拷貝數(shù)可以通過(guò)公式A=-ln[(N-X)/N]*N計(jì)算，從而解決了多個(gè)目標(biāo)分子存在于單個(gè)液滴中的可能性。dPCR在轉(zhuǎn)基因檢測(cè)方面的應(yīng)用仍處于研究和探索的階段。
由于現(xiàn)有的商業(yè)化數(shù)字PCR設(shè)備在物理上只設(shè)置了2個(gè)檢測(cè)通道，所以存在一個(gè)明顯的短板：不能同時(shí)進(jìn)行多個(gè)位點(diǎn)的檢測(cè)。在樣品多位點(diǎn)的檢測(cè)中，就需要更多的起始樣品，但臨床上組織的樣品非常有限。相比之下熒光定量PCR儀上就很容易實(shí)現(xiàn)多重檢測(cè)。為了考察利用數(shù)字PCR實(shí)現(xiàn)多重檢測(cè)的可能性，英國(guó)TheInstituteofCancerResearch的研究人員以非小細(xì)胞肺相關(guān)的KRAS基因?yàn)闄z測(cè)對(duì)象，在Bio-Rad的數(shù)字PCR系統(tǒng)上通過(guò)3個(gè)三重ddPCR檢測(cè)體系來(lái)實(shí)現(xiàn)9個(gè)KRAS突變位點(diǎn)的檢測(cè)。數(shù)字PCR作為研發(fā)階段的驗(yàn)證方案之一。廣東數(shù)字PCR儀器
數(shù)字PCR技術(shù)min檢測(cè)下限可到2copies/ml，比qPCR靈敏度提升了100倍。法國(guó)醫(yī)療系統(tǒng)認(rèn)證數(shù)字PCR技術(shù)
數(shù)字PCR的引物和探針設(shè)計(jì)規(guī)則同熒光定量PCR是類似的，具體規(guī)則如下：1、查找和選擇目標(biāo)序列設(shè)計(jì)引物和探針的第一步是得到感興趣基因的核酸序列。找到基因保守區(qū)域：基因的保守區(qū)域是指來(lái)自同一屬/種/亞型的、在某個(gè)基因上堿基序列差別很小或沒(méi)有差別的區(qū)域。根據(jù)需要，使用ClustalX或ClustalW等軟件對(duì)齊屬于同一屬/種/亞型的基因的一組序列，在對(duì)齊序列的保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物，并確保引物結(jié)合位點(diǎn)處的保守序列與其它非待檢測(cè)的屬/種/亞型的堿基序列具有較大的差異。擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度（AmpliconLength）：可在75-200bp之間（產(chǎn)物長(zhǎng)度=下游引物位置-上游引物位置+1）。法國(guó)醫(yī)療系統(tǒng)認(rèn)證數(shù)字PCR技術(shù)
廣州雙螺旋科學(xué)儀器有限公司在數(shù)字PCR，純水機(jī)，病理切片機(jī)，倍性分析儀一直在同行業(yè)中處于較強(qiáng)地位，無(wú)論是產(chǎn)品還是服務(wù)，其高水平的能力始終貫穿于其中。公司始建于2015-04-17，在全國(guó)各個(gè)地區(qū)建立了良好的商貿(mào)渠道和技術(shù)協(xié)作關(guān)系。雙螺旋科學(xué)儀器以數(shù)字PCR，純水機(jī)，病理切片機(jī)，倍性分析儀為主業(yè)，服務(wù)于精細(xì)化學(xué)品等領(lǐng)域，為全國(guó)客戶提供先進(jìn)數(shù)字PCR，純水機(jī)，病理切片機(jī)，倍性分析儀。多年來(lái)，已經(jīng)為我國(guó)精細(xì)化學(xué)品行業(yè)生產(chǎn)、經(jīng)濟(jì)等的發(fā)展做出了重要貢獻(xiàn)。