數(shù)字PCR技術(shù)流分類目前，dPCR的基本方法都已經(jīng)建立，根據(jù)反應(yīng)單元的不同形式，主要可分為微板式、微腔式和和微滴式三大類系統(tǒng)。微液滴制備的方法，目前主流的有四種：1）芯片微孔物理分割法，俗稱物理分隔法，公司有Fluidgm，Qiagen，Roche，ThermoFisher，;2）液滴分割法，俗稱油包水，代替公司有Bio-Rad;3）雜交式芯片液滴法，公司有Stilla;4）注射振動制滴法。PS：芯片式物理分割技術(shù)所有已經(jīng)過期，目前有不少公司在這個技術(shù)的基礎(chǔ)上進(jìn)行開發(fā)，例如羅氏。數(shù)字PCR是通過將一個樣本分成幾十到幾萬份，分配到不同的反應(yīng)單元，每個單元至少包含一個拷貝的目標(biāo)分子 。深圳銳訊數(shù)字PCR
現(xiàn)有dPCR分析方法采用熒光探針和基于光的檢測方法來鑒定擴(kuò)增產(chǎn)物。這些方法要求足夠的靶分子擴(kuò)增以產(chǎn)生足以被檢測到的信號，但可能會導(dǎo)致額外的錯誤或偏差，因此，希望能夠提供一種改進(jìn)的、用于檢測樣品內(nèi)感興趣的核酸的方法，其采用替代性分析方法，具有提高的準(zhǔn)確度和精確度，并且其具有可以與基于dPCR的方法關(guān)聯(lián)使用的靈敏度。dPCR還在樣品內(nèi)進(jìn)行單一反應(yīng)，但是所述樣品被分離成大量的分區(qū)(partition)，并且所述反應(yīng)在每個分區(qū)中單獨進(jìn)行。這種分離允許對核酸量進(jìn)行靈敏的測量。DPCR已被證明可有效用于研究基因序列中的變異，例如拷貝數(shù)變異或點突變。深圳銳訊數(shù)字PCR模板 DNA 量越多，熒光達(dá)到域值的循環(huán)數(shù)越少，即 Ct 值越小。
數(shù)字PCR平臺的評價指標(biāo)有：分割單元數(shù)，熒光通道數(shù)，操作復(fù)雜性和污染風(fēng)險。但是重要的是檢測準(zhǔn)確性，評估數(shù)字PCR平臺的一種方法是使用多個數(shù)字PCR平臺互相驗證，另一種方法是使用定值準(zhǔn)確的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。目前的三代的PCR技術(shù)各有各的優(yōu)缺點，也各有各的應(yīng)用領(lǐng)域，并不是一代取代一代的關(guān)系。技術(shù)的不斷進(jìn)步給PCR技術(shù)注入了新的活力，使其能解鎖一個又一個的應(yīng)用方向，使核酸檢測更方便、更準(zhǔn)確。目前dPCR儀器的價格仍然十分昂貴，但隨著系統(tǒng)加工工藝的改進(jìn)以及使用較便宜的材料，聚合成更小的體積[556]，其價格將會不斷的降低，使其應(yīng)用到更多的檢測中。
dPCR的結(jié)果統(tǒng)計方式有2種，一種是采用標(biāo)記多種顏色，通過不同檢測通道分辨不同顏色和強(qiáng)度，再根據(jù)分散液滴的數(shù)量計算待測基因的含量；另一種采用概率統(tǒng)計的數(shù)據(jù)處理方法，即通過泊松分布的方法對結(jié)果進(jìn)行分析。應(yīng)用概率統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)和對數(shù)據(jù)處理方法的模型直接關(guān)系著結(jié)果的準(zhǔn)確性和分析時間的長短。常用的統(tǒng)計方法是假設(shè)每個微反應(yīng)單元的體積相同，根據(jù)泊松統(tǒng)計計算拷貝數(shù)，公式為：M=-Vx1n（1-x/）其中M是目標(biāo)總拷貝數(shù)量；V是微反應(yīng)單元數(shù)量；x是發(fā)光的微反應(yīng)單元數(shù)量。數(shù)字PCR等新興技術(shù)要在臨床應(yīng)用上得到爆發(fā)式增長，有賴于LDT市場的放開。
dPCR在使用過程中需要特別注意體積誤差造成的結(jié)果偏差。體積誤差對于測量拷貝數(shù)濃度會產(chǎn)生偏差。目前dPCR中體積優(yōu)化方法以光學(xué)顯微鏡觀測為主。分散體積的差異會增加拷貝數(shù)結(jié)果的不確定性，Emslie等使用光學(xué)顯微鏡縱向拍照比較圖片邊緣的微小差異，考察了數(shù)字PCR系統(tǒng)中每個微孔內(nèi)和孔與孔間的體積差異對實驗結(jié)果的影響程度。Corbisier等使用微滴數(shù)字PCR對6種不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)棉籽粉質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)[ERM-AD623a-f，濃度范圍（10~10）copies/ul]進(jìn)行分析，優(yōu)化了液滴體積得到相應(yīng)校正因子，并使用該校正因子發(fā)現(xiàn)并校準(zhǔn)了運行軟件中液滴體積不變的假設(shè)而引起的數(shù)據(jù)偏離，數(shù)據(jù)結(jié)果的一致性有明顯提高。經(jīng)過PCR循環(huán)之后，有一個核酸分子模板的反應(yīng)器就會給出熒光信號，沒有模板的反應(yīng)器就沒有熒光信號。廣州銳訊數(shù)字PCR市場前景
無創(chuàng)產(chǎn)前篩查有望成為數(shù)字PCR在臨床快速落地的應(yīng)用。深圳銳訊數(shù)字PCR
ThermoFisherQuantStudio3D是另一個經(jīng)典的芯片式數(shù)字PCR平臺，其基本的檢測流程是：將反應(yīng)液加入到涂布器中，通過涂布器將反應(yīng)液均勻涂布在有20000個微孔的芯片上，將芯片放在PCR儀上擴(kuò)增，將芯片放入讀取儀中采取拍照的方式讀取熒光信號。操作較為復(fù)雜，整個過程在封閉的芯片中進(jìn)行，污染的風(fēng)險較低。STILLANaica是一個較新的數(shù)字PCR平臺，基本的檢測流程是：將反應(yīng)液加入芯片，將芯片放入微滴生成擴(kuò)增系統(tǒng)，生成30,000個微滴單層平鋪于芯片中，PCR擴(kuò)增在芯片上完成。然后將擴(kuò)增后的芯片轉(zhuǎn)移至微滴閱讀分析系統(tǒng)，采取拍照的方式讀取熒光信號。由于整個過程在封閉的芯片中進(jìn)行，污染的風(fēng)險較低。深圳銳訊數(shù)字PCR
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