天津細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑直銷價

細(xì)胞轉(zhuǎn)染，你至少要掌握以下幾點：主要有下面幾種方法：：化學(xué)法：磷酸鈣法、DEAE-右旋糖苷法、陽離子脂質(zhì)體法；物理法：電穿孔法、顯微注射法、顆粒傳遞法；細(xì)菌介導(dǎo)法：逆轉(zhuǎn)錄細(xì)菌、腺細(xì)菌A. 陽離子脂質(zhì)體法：帶正電的脂質(zhì)體與核酸帶負(fù)電的磷酸基團(tuán)形成復(fù)合物被細(xì)胞內(nèi)吞。特點：簡單通用，適用性廣，轉(zhuǎn)染效率高，重復(fù)性好，但轉(zhuǎn)染時需除血清，轉(zhuǎn)染效率隨細(xì)胞類型變化大。由于脂質(zhì)體復(fù)合物與貼壁細(xì)胞的接觸機(jī)會遠(yuǎn)大于懸浮細(xì)胞，所以貼壁比懸浮轉(zhuǎn)染效率要高。懸浮細(xì)胞建議使用電穿孔法。B. 電穿孔法：利用高壓電脈沖對細(xì)胞膜的干擾，使其形成利于核酸進(jìn)入的微孔。再通過融合或細(xì)胞內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞。天津細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑直銷價

如何有效提高細(xì)胞轉(zhuǎn)染實驗效率：1.選擇合適的轉(zhuǎn)染試劑不同細(xì)胞系轉(zhuǎn)染效率通常不同，但細(xì)胞系的選擇通常是根據(jù)實驗的需要，因此在轉(zhuǎn)染實驗前應(yīng)根據(jù)實驗要求和細(xì)胞特性選擇適合的轉(zhuǎn)染試劑。每種轉(zhuǎn)染試劑都會提供一些已經(jīng)成功轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株列表和文獻(xiàn)，通過這些資料可選擇較適合實驗設(shè)計的轉(zhuǎn)染試劑。當(dāng)然，較適合的是高效、低毒、方便、廉價的轉(zhuǎn)染試劑。2.保持較佳的細(xì)胞狀態(tài)一般低的細(xì)胞代數(shù)（<50）能確?；蛐筒蛔?。較適合轉(zhuǎn)染的細(xì)胞是經(jīng)過幾次傳代后達(dá)到指數(shù)生長期的細(xì)胞，細(xì)胞生長旺盛，較容易轉(zhuǎn)染。細(xì)胞培養(yǎng)在實驗室中保存數(shù)月和數(shù)年后會經(jīng)歷突變，總?cè)旧w重組或基因調(diào)控變化等而演化。這會導(dǎo)致和轉(zhuǎn)染相關(guān)的細(xì)胞行為的變化。也就是說同一種系的細(xì)胞株，在各實驗室不同培養(yǎng)條件下，其生物學(xué)性狀發(fā)生不同程度的改變，導(dǎo)致其轉(zhuǎn)染特性也發(fā)生變化。因此，如果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染效率降低，可以試著轉(zhuǎn)染新鮮培養(yǎng)的細(xì)胞以恢復(fù)較佳結(jié)果。蘇州細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)貨價重新接種于培養(yǎng)皿或瓶，較好在轉(zhuǎn)染前4小時換一次新鮮培養(yǎng)液。

細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率低下的幾個大坑：1.準(zhǔn)備不足做脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的時候，在開展正式實驗前要多做預(yù)試驗，優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件。優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件包括：脂質(zhì)體的用量、DNA密度、細(xì)胞密度、脂質(zhì)體和DNA混合孵育時間等等。2.電壓過大做電轉(zhuǎn)的時候，如果電壓太大，往往會發(fā)生細(xì)胞大量死亡的情況。不同的細(xì)胞，需要的電壓是不一樣的。這就要求我們多做預(yù)實驗，多摸索條件。對于大多數(shù)細(xì)胞來說，其較佳電壓位于250-1250v/cm。另外，就是進(jìn)行轉(zhuǎn)染的細(xì)胞應(yīng)該處于對數(shù)生長期。處于對數(shù)生長期的細(xì)胞的抗損傷能力是較強(qiáng)的。細(xì)胞濃度應(yīng)該處于5x106到1x107／mL之間。每次轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒應(yīng)該控制在4-6 μg，如果﹥10μg，轉(zhuǎn)染效率也較大降低。電擊后，應(yīng)該將DNA和細(xì)胞混合液在室溫下放置10分鐘，使細(xì)胞恢復(fù)損傷。

影響轉(zhuǎn)染試驗的因素：細(xì)胞狀態(tài)變化：（1）轉(zhuǎn)染試劑與細(xì)胞不匹配細(xì)胞轉(zhuǎn)染較適合的不是原代細(xì)胞，也不是傳代很多次的細(xì)胞。這是因為細(xì)胞培養(yǎng)在實驗室中保存數(shù)月和數(shù)年后會經(jīng)歷突變，總?cè)旧w重組或基因調(diào)控變化等而演化。這會導(dǎo)致和轉(zhuǎn)染相關(guān)的細(xì)胞行為的變化。較適合轉(zhuǎn)染的細(xì)胞是經(jīng)過幾次傳代后達(dá)到對數(shù)生長期的細(xì)胞，細(xì)胞生長旺盛，較容易轉(zhuǎn)染。（2）把握時機(jī)沒錯！轉(zhuǎn)染也有適當(dāng)?shù)臅r機(jī)，相比較非分裂細(xì)胞——分裂細(xì)胞往往要比靜止細(xì)胞更易于攝取并表達(dá)外源DNA。因此對大多數(shù)轉(zhuǎn)染操作而言，細(xì)胞都在轉(zhuǎn)染當(dāng)天或前現(xiàn)在種板。同樣重要的是細(xì)胞在種板進(jìn)行轉(zhuǎn)染時不應(yīng)處于過度生長的狀態(tài)，如細(xì)胞數(shù)量過多，互相疊加，營養(yǎng)物質(zhì)耗竭，代謝廢物積聚，轉(zhuǎn)染率低下也是很正常的！僅有一部分轉(zhuǎn)入細(xì)胞的DNA被轉(zhuǎn)運到細(xì)胞核內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄并較終輸出mRNA到細(xì)胞質(zhì)進(jìn)行蛋白合成。

DNA細(xì)胞轉(zhuǎn)染步驟：1.提前現(xiàn)在細(xì)胞鋪板 提前現(xiàn)在將細(xì)胞種植在24孔板中，以轉(zhuǎn)染時細(xì)胞密度在60％左右為宜。2.轉(zhuǎn)染過程⑴將0.8μg的DNA用25μl無血清稀釋液稀釋，充分混勻，制成DNA稀釋液。 注意：無血清稀釋液建議采用OPTI-MEM、無血清DMEM或1640。⑵將2μlEntransterTM-H4000用25μl無血清稀釋液體稀釋，充分混勻，制成EntransterTM-H4000稀釋液。室溫靜置5分鐘。⑶將EntransterTM-H4000稀釋液分別加入到DNA稀釋液中，充分混勻（可用振蕩器振蕩或用加樣器吹吸10次以上），室溫靜置15分鐘。轉(zhuǎn)染復(fù)合物制備完成。⑷將轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入到含細(xì)胞和完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)容器上，輕柔混勻。 注意：①對本試劑，采用含血清的全培養(yǎng)基有助于提升轉(zhuǎn)染效率。②完全培養(yǎng)基可加物品。在現(xiàn)生命可續(xù)研究中，大部分的工作是利用基因功能研究來探索生命過程。寧波細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑廠家供應(yīng)

到時后，根據(jù)細(xì)胞種類決定是否移除混合液。天津細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑直銷價

細(xì)胞轉(zhuǎn)染常用步驟：1.轉(zhuǎn)染試劑的準(zhǔn)備①將400ul去核酸酶水加入管中，震蕩10秒鐘，溶解脂狀物。②震蕩后將試劑放在－20攝氏度保存，使用前還需震蕩。2.選擇合適的混合比例(1：1－1：2/脂質(zhì)體體積：DNA質(zhì)量)來轉(zhuǎn)染細(xì)胞。在一個轉(zhuǎn)染管中加入合適體積的無血清培養(yǎng)基。加入合適質(zhì)量的MyoD或者EGFP的DNA，震蕩后在加入合適體積的轉(zhuǎn)染試劑，再次震蕩。3.將混合液在室溫放置10―15分鐘。4.吸去培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基，用PBS或者無血清培養(yǎng)基清洗一次。5.加入混合液，將細(xì)胞放回培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一個小時。6.到時后，根據(jù)細(xì)胞種類決定是否移除混合液，之后加入完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24－48小時。天津細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑直銷價

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