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來源: 發(fā)布時間:2024-06-05

外泌體鑒定:外泌體分離之后,需要經(jīng)過一系列鑒定才能確定分離的是外泌體。鑒定方法從物理特征到表面分子標(biāo)志物,多角度進(jìn)行鑒定。l透射電鏡鑒定法:簡稱TEM,適合外泌體雙層囊膜超微結(jié)構(gòu)觀察,即通常為茶托型或一側(cè)凹陷的半球形。l納米顆粒追蹤分析法:簡稱NTA,該方法能保證外泌體原始狀態(tài)、檢測速度快,檢測后能提供外泌體粒徑和濃度信息。lWesternblot分子標(biāo)志物檢測:外泌體標(biāo)志蛋白包括四跨膜蛋白家族,如CD9、CD63和CD81;細(xì)胞質(zhì)蛋白,如肌動蛋白(Actin)和鈣磷脂結(jié)合蛋白(Annexins);使用可截留100KD分子量的膜,通過離心截留上清中的外泌體,截留完成后。靜置10~15分鐘,留取沉淀物備用。南昌外泌體提取試劑直銷價

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外泌體研究的主要應(yīng)用:外泌體的功能取決于其所來源的細(xì)胞類型,其可參與到機(jī)體免疫應(yīng)答、抗原提呈、細(xì)胞遷移、細(xì)胞分化、一些病癥侵襲等方方面面。有研究表明一些病癥來源的外泌體參與到一些病癥細(xì)胞與基底細(xì)胞的遺傳信息的交換,從而導(dǎo)致大量新生血管的生成,促進(jìn)了一些病癥的生長與侵襲。一些病癥。一些病癥轉(zhuǎn)移。來自白血病干細(xì)胞的外泌體促進(jìn)急性骨髓性白血?。ˋML)細(xì)胞的增殖、遷移和壓制細(xì)胞凋亡。治病靶標(biāo)。利用外泌體遞送小干擾RNA來沉默KRASG12D,從而特異性高效靶向至胰腺病細(xì)胞,以明顯降低RAS活化、病細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移過程。免疫。β細(xì)胞將含有蛋白質(zhì)和miRNA的外泌體釋放到細(xì)胞外,并可轉(zhuǎn)移到其他代謝部位或免疫內(nèi)皮細(xì)胞,有利于維持葡萄糖體內(nèi)平衡或造成胰島素抵抗。心血管。外泌體介導(dǎo)miR-155從平滑肌細(xì)胞轉(zhuǎn)移到內(nèi)皮細(xì)胞導(dǎo)致了內(nèi)皮細(xì)胞的損傷促進(jìn)動脈硬化。分子標(biāo)記。疾病診斷。在酒精性肝病、NASH、菌類性肝炎、藥物性肝損傷和肝細(xì)胞病中發(fā)現(xiàn)循環(huán)EVs的水平上升。預(yù)后標(biāo)志。寧波外泌體提取試劑進(jìn)貨價外泌體提?。夯诰酆衔锏某恋砑夹g(shù)。

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具體步驟是:以下所有步驟都在4℃下進(jìn)行,1、300×g10min,棄沉淀,去除細(xì)胞2、2000×g20min,棄沉淀,去除死細(xì)胞3、10,000×g30min,棄沉淀,去除細(xì)胞碎片等亞細(xì)胞成分4、10,000×g70min,棄上清,沉淀即為外泌體5、PBS(每10ml細(xì)胞培養(yǎng)液用30mlPBS重懸)清洗沉淀物,混勻,10,000×g70min6、lmlPBS溶解沉淀(外泌體),立即使用或置于-80℃?zhèn)溆谩?、一般超速離心法會結(jié)合密度梯度離心,這樣得到的外泌體更純,具體做法第4步后蔗糖梯度離心,10,000×g70min,以去除密度大于1.21g/ml的顆粒。優(yōu)點(diǎn)是:成本低,操作簡單,獲得的囊泡數(shù)較多。缺點(diǎn)是:耗時耗力(需用時8-30h,并且每次只能處理6個樣本),獲得的外泌體純度不是很高,高速及重復(fù)離心也會對外泌體產(chǎn)生很大的傷害,并且不適用于如血漿和血清等粘性液體生物樣本。

外泌體的提取主要包括以下幾種方式:一是超速離心法,這是目前外泌體提取較常用的方法。此種方法得到的外泌體量多,但是純度不足,電鏡鑒定時發(fā)現(xiàn)外泌體聚集成塊,由于微泡和外泌體沒有非常統(tǒng)一的鑒定標(biāo)準(zhǔn),也有一些研究認(rèn)為此種方法得到的是微泡不是外泌體。二是過濾離心,這種操作簡單、省時,不影響外泌體的生物活性,但同樣存在純度不足的問題。三是密度梯度離心法,用此種方法分離到的外泌體純度高,但是前期準(zhǔn)備工作繁雜,耗時,量少。四是免疫磁珠法,這種方法可以保證外泌體形態(tài)的完整,特異性高、操作簡單、不需要昂貴的儀器設(shè)備,但是非中性pH和非生理性鹽濃度會影響外泌體生物活性,不便進(jìn)行下一步的實(shí)驗。五是PS親和法,該方法將PS(磷脂酰絲氨酸)與磁珠結(jié)合,利用親和原理捕獲外泌體囊泡外的PS。該方法與免疫磁珠法相似,獲得的外泌體形態(tài)完整,純度較高。由于不使用變性劑,不影響外泌體的生物活性,外泌體可用于細(xì)胞共培養(yǎng)和體內(nèi)注射。2016.9《ScientificReports》雜志發(fā)表了該方法較新數(shù)據(jù),表明PS法可提取相當(dāng)高純度的外泌體。六是色譜法,這種方法分離到的外泌體在電鏡下大小均一,但是需要特殊的設(shè)備,應(yīng)用不普遍。外泌體作為內(nèi)源性的天然藥物載體有著獨(dú)特的優(yōu)勢,表面由脂質(zhì)和蛋白質(zhì)組成。

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外泌體的提取分離:1、超速離心法(差速離心)。超離法是常用的外泌體純化手段,采用低速離心、高速離心交替進(jìn)行(如圖所示),可分離到大小相近的囊泡顆粒。超離法因操作簡單,獲得的囊泡數(shù)量較多而廣受歡迎,但過程比較費(fèi)時,且回收率不穩(wěn)定(可能與轉(zhuǎn)子類型有關(guān)),純度也受到質(zhì)疑;此外,重復(fù)離心操作還有可能對囊泡造成損害,從而降低其質(zhì)量。2、密度梯度離心。在超速離心力作用下,使蔗糖溶液形成從低到高連續(xù)分布的密度階層,是一種區(qū)帶分離法。通過密度梯度離心,樣品中的外泌體將在1.13-1.19g/ml的密度范圍富集。此法獲得的外泌體純度較高,但步驟繁瑣,耗時。外泌體提?。好庖叻蛛x外泌體的原理大多是通過抗體包被的微球,特異性結(jié)合外泌體。蕪湖外泌體提取試劑哪家好

根據(jù)外泌體表面的特異生物化學(xué)特性通過提取試劑的特異配方把外泌體從水相中沉降下來。南昌外泌體提取試劑直銷價

腦組織分離方法簡述:將腦組織剪成薄片,放入離心管中加上消化液進(jìn)行消化,經(jīng)水浴、反復(fù)輕輕上下顛倒,再用移液間斷緩慢吹吸至消化結(jié)束。隨后加入培養(yǎng)基于消化液中,混勻,置于冰上。再進(jìn)行一系列的差速超速離心過程,包括除雜、濾膜過濾、超離等。較后用PBS重懸外泌體,用重懸后的外泌體進(jìn)行下面的透射電鏡(TEM)、納米粒徑追蹤分子(NTA)和markerWB鑒定。外泌體(Exosomes)是細(xì)胞分泌到胞外的一種囊泡(ExtracellularVesicles,EVs),其大小為30-150nm,具有雙層膜結(jié)構(gòu)和茶托狀形態(tài),含有豐富的內(nèi)含物(包括核酸、蛋白和脂質(zhì)等),參與細(xì)胞間的分子傳遞。外泌體普遍存在于細(xì)胞培養(yǎng)上清以及各種體液中,包括血液、唾液、尿液、、乳汁等,同時也存在于組織樣本中,如腦組織、肌肉組織、脂肪組織等。南昌外泌體提取試劑直銷價