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來源: 發(fā)布時間:2021-12-09

    基因?qū)嶒炇遗cPCR實驗室的規(guī)劃布局要求:1、環(huán)境要求通風(fēng)、溫度和濕度實驗室的長期使用,有毒、有害等污濁氣體不及時排出會危害室內(nèi)操作人員健康。實驗室良好的通風(fēng)環(huán)境是必要前提。除了實驗室建筑選址的朝向和所處地域的氣候特征,實驗室通風(fēng)系統(tǒng)也是必須考慮的問題。通風(fēng)柜作為保持實驗室內(nèi)安全、衛(wèi)生的重要柜體,是建立一個科學(xué)實驗室必不可少的組成部分。潔凈度實驗室的潔凈,除了實驗室地面、實驗室器具的清潔,還要考慮實驗室內(nèi)空氣的潔凈度。不良的空氣質(zhì)量會影響實驗的正常進(jìn)行,擴(kuò)散到空氣中的有害物質(zhì)也會危害到人體健康。2、設(shè)施要求給排水、排污系統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范的實驗室,都會配置有供水、排水和排污系統(tǒng),實驗臺配置水池、滴水架、排水槽,通風(fēng)柜與通風(fēng)柜管道聯(lián)通。3、實驗室工作人員要求PCR實驗室內(nèi)工作人員必須參加由國家衛(wèi)生部或各省臨床檢驗中心舉辦的臨床基因擴(kuò)增培訓(xùn)班,并持證上崗。PCR實驗室通過驗收,實驗室至少必須應(yīng)有兩個以上持有“臨床基因檢測上崗證”。PCR實驗室必須建立嚴(yán)格的實驗室管理制度、建立標(biāo)準(zhǔn)化操作程序(SOP)、建立系列質(zhì)量管理文件等,確保實驗室日常運行符合國家衛(wèi)生部的要求,確保檢測結(jié)果準(zhǔn)確、確保實驗室衛(wèi)生安全。PCR儀是利用DNA聚合酶進(jìn)行專一性的連鎖復(fù)制。國產(chǎn)高??蒲蠵CR儀批發(fā)廠家

    1.一般性原則(1)長度:一般引物互補區(qū)的長度為16-25bp,引物互補區(qū)的4×(G十C)十2×(A十T)不要沒有必要大于70,一般也不要低于50(2)G十c含量:好在45%一55%之間,但有時受模板限制,無法理想化。但在有幾種選擇時,可以把G十c含量接近50%作為參數(shù)之一(3)堿基分布的隨機(jī)性:應(yīng)避免連續(xù)出現(xiàn)4個以上的單一堿基。尤其是不應(yīng)在其3’端出現(xiàn)超過3個的連續(xù)G或C,否則會使引物在G十C富集序列區(qū)錯誤引發(fā)。(4)引物自身:不能含有很長的牢固的自身互補序列,尤其是引物3‘端回折形成的發(fā)夾不要一般超過3堿基,否則會影響引物與模板的結(jié)合(5)引物之間:兩個引物之間不應(yīng)有很長的牢固的互補或同源堿基,尤應(yīng)避免3’端的互補重疊。2.具體原則①引物長度;特異性一般通過引物長度和退火溫度控制。如果PCR的退火溫度設(shè)置在近于引物Tm值(引物/模板雙鏈體的解鏈溫度)幾度的范圍內(nèi),18到24個堿基的寡核苷酸鏈?zhǔn)怯泻芎玫男蛄刑禺愋缘摹R镌介L,擴(kuò)增退火時被引發(fā)的模板越少。為優(yōu)化PCR反應(yīng),使用確保溶解溫度不低于54℃的短的引物,可獲得好的效率和特異性??偟膩碚f,好在特異性允許的范圍內(nèi)尋求安全性。每增加一個核苷酸,引物特異性提高4倍;這樣,大多數(shù)應(yīng)用的短引物長度為18個核苷酸。 上海實時熒光PCR儀銷售價格PCR的三個反應(yīng)(變性-退火-延伸)0步驟反復(fù)進(jìn)行,使DNA擴(kuò)增量呈指數(shù)上升。

    引物設(shè)計時使合成的寡核苷酸鏈(18~24聚物)適用于多種實驗條件仍不失為明智之舉。②引物的二級結(jié)構(gòu)包括引物自身二聚體、發(fā)卡結(jié)構(gòu)、引物間二聚體等。這些因素會影響引物和模板的結(jié)合從而影響引物效率。對于引物的3’末端形成的二聚體,應(yīng)控制其ΔG大于,因為此種情形的引物二聚體有進(jìn)一步形成更穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的可能性,引物中間或5’端的要求可適當(dāng)放寬。引物自身形成的發(fā)卡結(jié)構(gòu),也以3’端或近3’端對引物-模板結(jié)合影響更大;影響發(fā)卡結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性的因素除了堿基互補配對的鍵能之外,與莖環(huán)結(jié)構(gòu)形式亦有很大的關(guān)系。應(yīng)盡量避免3’末端有發(fā)卡結(jié)構(gòu)的引物。③引物GC含量和Tm值PCR引物應(yīng)該保持合理的GC含量。含有50%的G+C的20個堿基的寡核苷酸鏈的Tm值大概在56~62℃范圍內(nèi),這可為有效退火提供足夠熱度。一對引物的GC含量和Tm值應(yīng)該協(xié)調(diào)。協(xié)調(diào)性差的引物對的效率和特異性都較差,因為降低了Tm值導(dǎo)致特異性的喪失。這種情況下引物Tm值越高,其錯誤引發(fā)的機(jī)率也越大。若采用太高的退火溫度,Tm值低的引物對可能完全不發(fā)揮作用。在從一批在特定序列范圍內(nèi)已合成好的寡核苷酸中選擇一對新的引物時,這種GC含量和Tm值的協(xié)調(diào)非常關(guān)鍵。一般來說。

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