非洲豬瘟的影響范圍是非常大的,很多家豬或者野豬都極易受到非洲豬瘟病毒的傳染,再加上對(duì)于非洲豬瘟,我們無法一勞永逸的解決,養(yǎng)殖戶只能不斷檢測(cè),避免豬瘟的苗頭出現(xiàn),同時(shí)注意養(yǎng)殖場(chǎng)內(nèi)的消毒工作,可以有效的減少非洲豬瘟傳染的概率。在分子生物學(xué)中,經(jīng)常會(huì)遇到細(xì)胞分裂的處理,這些處理方式利用人工來做的話,花費(fèi)的時(shí)間往往極多,這就造成不必要的人力、物力浪費(fèi),是非常不合算的,所以我們一般利用基因擴(kuò)增儀器進(jìn)行這方面的處理,在很多實(shí)驗(yàn)室的使用過程中,取得了良好的成效。利用基因擴(kuò)增儀器既可節(jié)省試驗(yàn)時(shí)間,提高實(shí)驗(yàn)效率,又能節(jié)約實(shí)驗(yàn)成本,同時(shí)根據(jù)不同的試驗(yàn)進(jìn)行不同的設(shè)置,基因擴(kuò)增儀器是為滿足當(dāng)今分子生物實(shí)驗(yàn)室的需求所設(shè)計(jì),該儀器可以進(jìn)行任何實(shí)時(shí)PCR檢測(cè),如病原體、突變、SNP的分析和快速篩選、細(xì)胞RNA水平的檢測(cè)和量化等。封閉的反應(yīng)體系,將污染降低。該儀器能夠?qū)?shù)據(jù)進(jìn)行實(shí)時(shí)收集和分析,其高效的數(shù)據(jù)管理能力使用戶迅速生成數(shù)據(jù)和進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)。PCR儀也叫基因擴(kuò)增儀。力康實(shí)驗(yàn)室PCR儀價(jià)格表格
選擇該物種使用頻率高的密碼子,以降低引物的簡(jiǎn)并性。③應(yīng)努力避免3’末端的簡(jiǎn)并,對(duì)于大多數(shù)氨基酸殘基來說,意味著引物3’末端不要位于密碼子的第三位。④在一些多義位置使用脫氧次黃嘌呤(dI)代替簡(jiǎn)并堿基。4.測(cè)序引物設(shè)計(jì)當(dāng)然,測(cè)序引物的設(shè)計(jì)一般都由測(cè)序公司來完成,如果需要自己設(shè)計(jì)的話;那么除了按照上面所提到的引物設(shè)計(jì)通用標(biāo)準(zhǔn)外,還需要注意兩點(diǎn):①測(cè)序引物的特異性的標(biāo)準(zhǔn)掌握應(yīng)該更嚴(yán)格一些,也就是說設(shè)計(jì)時(shí)更優(yōu)先考慮特異性。因?yàn)樵跍y(cè)序反應(yīng)中,如果引物與模板在非預(yù)期位置退火并引發(fā)鏈延伸,會(huì)對(duì)結(jié)果對(duì)來很大的干擾甚至造成結(jié)果無法識(shí)讀。②測(cè)序引物的Tm值適當(dāng)高一些?,F(xiàn)在大部分測(cè)序反應(yīng)均選用耐熱的測(cè)序級(jí)DNA聚合酶來催化,并采用PCR的熱循環(huán)程序。選用的測(cè)序引物的Tm值稍高一些,有助于使反應(yīng)順利跨過待測(cè)模板的二級(jí)結(jié)構(gòu)區(qū),也有助于降低非特異反應(yīng)。5.探針的設(shè)計(jì)探針的設(shè)計(jì),根據(jù)不同的用途各有其設(shè)計(jì)特點(diǎn),這里只是就通用的原則進(jìn)行討論:①探針的長(zhǎng)短一般在20-50核苷酸之間,過長(zhǎng)合成成本高,且易出現(xiàn)聚合酶合成錯(cuò)誤,雜交時(shí)間長(zhǎng)。太短則特異性下降。②注意G和C的含量努力控制在40-60%,同時(shí)一種堿基連續(xù)重復(fù)不超過4個(gè),以免非特異性雜交產(chǎn)生。 上海梯度PCR儀價(jià)格行情在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)中,pcr儀對(duì)傳染疾病的診斷意義尤為重要。
1988年初,Keohanog改用T4DNA聚合酶進(jìn)行PCR,其擴(kuò)增的DN段很均一,真實(shí)性也較高,只有所期望的一種DN段。但每循環(huán)一次,仍需加入新酶。1988年Saiki等從溫泉中分離的一株水生嗜熱桿菌thermusaquaticus中提取到一種耐熱DNA聚合酶。此酶具有以下特點(diǎn):①耐高溫,在70℃下反應(yīng)2h后其殘留活性大于原來的90%,在93℃下反應(yīng)2h后其殘留活性是原來的60%,在95℃下反應(yīng)2h后其殘留活性是原來的40%。②在熱變性時(shí)不會(huì)被鈍化,不必在每次擴(kuò)增反應(yīng)后再加新酶。③提高了擴(kuò)增片段特異性和擴(kuò)增效率,增加了擴(kuò)增長(zhǎng)度。由于提高了擴(kuò)增的特異性和效率,因而其靈敏性也提高。為與大腸桿菌多聚酶IKlenow片段區(qū)別,將此酶命名為TaqDNA多聚酶TaqDNAPolymerase。此酶的發(fā)現(xiàn)使PCR的被應(yīng)用。
PCR儀的基本原理類似于DNA的天然復(fù)制過程,其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。PCR由變性--退火--延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成:1、模板DNA的變性:模板DNA經(jīng)加熱至93℃左右一定時(shí)間后,使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離,使之成為單鏈,以便它與引物結(jié)合,為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備;2、模板DNA與引物的退火(復(fù)性):模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后,溫度降至55℃左右,引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合;3、引物的延伸:DNA模板--引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下,以dNTP為反應(yīng)原料,靶序列為模板,按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理,合成一條新的與模板DNA鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈重復(fù)循環(huán)變性--退火--延伸三過程,就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈",而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個(gè)循環(huán)需2~4分鐘,2~3小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬倍(Plateau)。到達(dá)平臺(tái)期所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝。在此同時(shí)認(rèn)識(shí)到蛋白質(zhì)是接受RNA的遺傳信息而合成的。50年代Zamecnik等在形態(tài)學(xué)和分離的亞細(xì)胞組分實(shí)驗(yàn)中已發(fā)現(xiàn)微粒體(microsome)是細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成的部位。 PCR技術(shù)的基本原理類似于DNA的天然復(fù)制過程,其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物.
目前,采用熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)可以對(duì)淋球菌、沙眼衣原體、解脲支原體、人類瘤病毒、單純皰疹病毒、人類免疫缺陷病毒、肝炎病毒、流感病毒、結(jié)核分枝桿菌、EB病毒和巨細(xì)胞病毒等病原體進(jìn)行定量測(cè)定。與傳統(tǒng)的檢測(cè)方法相比具有靈敏度高、取樣少、快速簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)。如:結(jié)核菌基因診斷的意義主要表現(xiàn)在:a.區(qū)分TB與其它分枝桿菌;b.檢測(cè)TB耐藥基因;c.提高TB的陽性檢出率。⑵產(chǎn)前診斷到目前為止,人們對(duì)遺傳性物質(zhì)改變引起的遺傳性疾病還無法,只能通過產(chǎn)前監(jiān)測(cè),減少病嬰出生,以防止各類遺傳性疾病的發(fā)生,如為減少X連鎖遺傳病患兒的出生,從孕婦的外周血中分離胎兒DNA,用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)其Y性別決定區(qū)基因是一種無創(chuàng)傷性的方法,易為孕婦所接受。⑶藥物療效考核對(duì)乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)定量分析顯示:病毒量與某些藥物的療效關(guān)系。HCV高水平表達(dá),干擾素作用不敏感,而HCV低滴度,干擾素作用敏感;在拉米夫定過程中,HBV-DNA的血清含量曾有下降,隨后若再度上升或超出以前水平,則提示病毒發(fā)生變異。如PCR技術(shù)在HBV檢測(cè)中的應(yīng)用及意義:a.了解乙肝病毒在體內(nèi)存在的數(shù)量。b.是否復(fù)制。c.是否傳染,傳染性有多強(qiáng)。d.是否有必要服藥。 臨床診斷、法醫(yī)學(xué)調(diào)查和農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究等領(lǐng)域要求設(shè)備有可靠的性能、靈敏度和標(biāo)準(zhǔn),pcr儀正巧合適。國產(chǎn)熒光定量PCR儀價(jià)格信息
PCR擴(kuò)增過程中,熒光定量PCR儀通過熒光信號(hào),對(duì)PCR進(jìn)程進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)。力康實(shí)驗(yàn)室PCR儀價(jià)格表格
1.一般性原則(1)長(zhǎng)度:一般引物互補(bǔ)區(qū)的長(zhǎng)度為16-25bp,引物互補(bǔ)區(qū)的4×(G十C)十2×(A十T)不要沒有必要大于70,一般也不要低于50(2)G十c含量:好在45%一55%之間,但有時(shí)受模板限制,無法理想化。但在有幾種選擇時(shí),可以把G十c含量接近50%作為參數(shù)之一(3)堿基分布的隨機(jī)性:應(yīng)避免連續(xù)出現(xiàn)4個(gè)以上的單一堿基。尤其是不應(yīng)在其3’端出現(xiàn)超過3個(gè)的連續(xù)G或C,否則會(huì)使引物在G十C富集序列區(qū)錯(cuò)誤引發(fā)。(4)引物自身:不能含有很長(zhǎng)的牢固的自身互補(bǔ)序列,尤其是引物3‘端回折形成的發(fā)夾不要一般超過3堿基,否則會(huì)影響引物與模板的結(jié)合(5)引物之間:兩個(gè)引物之間不應(yīng)有很長(zhǎng)的牢固的互補(bǔ)或同源堿基,尤應(yīng)避免3’端的互補(bǔ)重疊。2.具體原則①引物長(zhǎng)度;特異性一般通過引物長(zhǎng)度和退火溫度控制。如果PCR的退火溫度設(shè)置在近于引物Tm值(引物/模板雙鏈體的解鏈溫度)幾度的范圍內(nèi),18到24個(gè)堿基的寡核苷酸鏈?zhǔn)怯泻芎玫男蛄刑禺愋缘?。引物越長(zhǎng),擴(kuò)增退火時(shí)被引發(fā)的模板越少。為優(yōu)化PCR反應(yīng),使用確保溶解溫度不低于54℃的短的引物,可獲得好的效率和特異性??偟膩碚f,好在特異性允許的范圍內(nèi)尋求安全性。每增加一個(gè)核苷酸,引物特異性提高4倍;這樣,大多數(shù)應(yīng)用的短引物長(zhǎng)度為18個(gè)核苷酸。 力康實(shí)驗(yàn)室PCR儀價(jià)格表格
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