顯微鏡熒光染料DIL

Cy3 (Cyanine 3) 是一種發(fā)橘黃色熒光的花青素?zé)晒馊玖?。Cy3染料的激發(fā)峰和發(fā)射峰分別在550 nm和570 nm左右，它的熒光肉眼觀察很明亮，并且對pH不敏感，在共聚焦顯微鏡中可以用532nm（肩峰）或者556nm（頂峰）的激光束激發(fā)，在普通熒光顯微鏡中可以用 TRITC (tetramethylrhodamine) 的濾片觀察，所以在絕大部分熒光儀器上都可以使用。Cy3也是Dil等細(xì)胞電位追蹤劑的母核，所以它是在生物技術(shù)中非常有用的熒光染料。在熒光成像時(shí)，Cy3的背景熒光一般認(rèn)為比TAMRA等TRITC系列的染料低。 Cy3可以用來標(biāo)記蛋白，抗體，多肽等，它常見的使用是標(biāo)記核酸分子（DNA和RNA）?；跓晒鈭D譜的相似性，Cy3可以被TAMRA，TRITC, BODIPY TMR等染料替代，在需要更明亮，更穩(wěn)定的替代物時(shí)，可以考慮使用AF547或者AF555等。南京星葉生物熒光染料標(biāo)記蛋白。顯微鏡熒光染料DIL

熒光染料，由于靈敏度高，操作方便，逐漸取代了放射性同位素作為檢測標(biāo)記，其廣泛應(yīng)用于熒光免疫，熒光探針，細(xì)胞染色等。包括特異性的DNA染色，用于染色體分析、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡等相關(guān)研究。另有很多核酸染料在多色染色系統(tǒng)中是非常有用的復(fù)染劑，可作為背景對照，標(biāo)記細(xì)胞核使細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)的空間關(guān)系一目了然。熒光標(biāo)記的單克隆抗體技術(shù)為流式細(xì)胞儀在研究細(xì)胞膜和細(xì)胞內(nèi)各種功能性抗原、**基因蛋白等領(lǐng)域擴(kuò)展了無限的應(yīng)用空間。熒光探針可以通過蛋白質(zhì)交聯(lián)劑共價(jià)結(jié)合在單克隆抗體上。免疫熒光標(biāo)記**常用的染料有異硫氰酸熒光素(fluoresceinisothiocyanate,FITC)、藻紅蛋白(PE)以及AlexaFluor系列染料等。核酸熒光染料對細(xì)胞核染色后定量測量細(xì)胞所發(fā)出的熒光強(qiáng)度，就可以確定細(xì)胞核中DNA、RNA的含量，并可以對細(xì)胞周期和細(xì)胞的增殖狀況進(jìn)行分析。有多種熒光染料可以對細(xì)胞中的DNA或RNA染色，常用的DNA染料包括碘化丙啶(PI)、DAPI、Hoechst33342等，RNA染料有噻唑橙、吖啶橙等。多肽熒光染料熒光素鉀鹽FITC熒光染料標(biāo)記方法。

羅丹明屬于呫噸族。與市場上的許多其他染料相比，羅丹明具有出色的光穩(wěn)定性以及許多光物理特性，使其非常適合用作激光染料、熒光探針和顏料。它們在聚合物納米粒子表面的表征、聚合物-生物偶聯(lián)物的檢測、活細(xì)胞的成像以及寡核苷酸在膠乳上的吸附分析等方面特別有用。羅丹明熒光染料的衍生物也用作：分子開關(guān)，病毒表面修飾，化學(xué)傳感器，硫醇。不同類型的染料通過它們各自的取代基（R1、R2、R3、R4和G）來區(qū)分。由于它們的差異，這些熒光染料在溶液中也表現(xiàn)出不同的光物理特性（例如不同的熒光壽命和發(fā)射比較大值）。氨基被剛性化的羅丹明染料無論溫度范圍如何都表現(xiàn)出高量子產(chǎn)率，而在每個(gè)氮處具有兩個(gè)烷基取代基的那些表現(xiàn)出活化的內(nèi)部轉(zhuǎn)化，量子產(chǎn)率和熒光壽命隨溫度的變化而變化。羅丹明101和羅丹明B是一些**常用的羅丹明染料具有以下特點(diǎn)：--羧基傾向于在酸性溶液中質(zhì)子化--染料轉(zhuǎn)化為兩性離子堿性溶液--兩性離子染料在極性較小的有機(jī)溶劑中變?yōu)闊o色內(nèi)酯要將羅丹明用作熒光探針，必須對其進(jìn)行修改。這可以通過(thexanthenemoiety)氨基、羧基苯基環(huán)或羧酸基團(tuán)的修飾來實(shí)現(xiàn)。與TRITC一樣，羅丹明(NHS-rhodamine)的熒光特性為544nm（比較大吸收波長）和576nm（比較大發(fā)射）。

三、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)D-熒光素鉀鹽體外生物發(fā)光試驗(yàn)：D-熒光素鉀鹽，無菌純水，完全培養(yǎng)基（自行配制）1、貼壁細(xì)胞：將細(xì)胞接種于培養(yǎng)板中孵育數(shù)小時(shí)或過夜，使細(xì)胞貼壁。懸浮細(xì)胞：可以將細(xì)胞接種于培養(yǎng)板后直接進(jìn)行后續(xù)操作，無需孵育。如果倍增時(shí)間相對較短，則應(yīng)考慮倍增時(shí)間進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。2、將15mg熒光素鉀鹽溶解于1ml無菌水中，制備成100X熒光素儲(chǔ)備液（15mg/ml），輕輕顛倒搖動(dòng)至熒光素鉀鹽完全溶解。混勻后立即使用或分裝后-20℃凍存。3、用預(yù)熱好的細(xì)胞培養(yǎng)基1∶100稀釋100X熒光素儲(chǔ)備液（15mg/ml），配制成熒光素工作液（終濃度150μg/ml），即配即用。4、去除培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基。5、在成像前，將適量熒光素工作液加入細(xì)胞中，然后進(jìn)行圖像分析。注意：成像前在37℃下對細(xì)胞進(jìn)行短時(shí)間孵育可增強(qiáng)信號。孵育時(shí)間取決于特定的細(xì)胞類型。一般來說孵育10分鐘就足夠了，根據(jù)需要進(jìn)行測試和調(diào)整。6、每隔10分鐘，**多40分鐘，使用VILBERFUSIONFX成像系統(tǒng)檢查體外生物發(fā)光，確定動(dòng)力學(xué)曲線并找出細(xì)胞的峰值成像時(shí)間點(diǎn)PI是一種可對DNA染色的細(xì)胞核染色試劑，它在嵌入雙鏈DNA后釋放紅色熒光。

琥珀酰亞胺酯（Succinimidylesters）/NHS酯活性熒光染料用于標(biāo)記抗體，蛋白質(zhì)，肽，胺修飾的寡核苷酸和其他生物分子上的游離氨基（-NH2）2、馬來酰亞胺（Maleimides）活性熒光染料用于標(biāo)記抗體，蛋白質(zhì)和肽上的巰基3、疊氮化物(Azides)活性熒光染料通過點(diǎn)擊化學(xué)法（Click）標(biāo)記乙烯基4、炔烴(Alkynes)活性熒光染料通過點(diǎn)擊化學(xué)方法標(biāo)記疊氮化物5、羧酸(Carboxylicacids)活性熒光染料經(jīng)碳二亞胺預(yù)活化后用于標(biāo)記胺或用于醇的Steglich酯化6、氨基(Amines)活性熒光染料具有游離氨基的熒光染料，用于與各種親電子化合物（如活化的酯和環(huán)氧化物）偶聯(lián)。Cy5.5含有一個(gè)游離胺基,可與多種官能團(tuán)共軛,包括NHS酯和環(huán)氧化合物。脂溶熒光染料發(fā)射

羅丹明具有出色的光穩(wěn)定性以及許多光物理特性，使其非常適合用作激光染料、熒光探針和顏料。顯微鏡熒光染料DIL

三、流式細(xì)胞儀分析1、取對數(shù)生長期的細(xì)胞，接種到孔板，過夜培養(yǎng)。2、如果要進(jìn)行藥物刺激，在細(xì)胞中加入感興趣的藥物進(jìn)行干預(yù)，繼續(xù)培養(yǎng)一定時(shí)間后，收集細(xì)胞，PBS清洗2次。3、加入Rhodamine123工作液重懸細(xì)胞，37℃避光孵育15min或更長時(shí)間。【注意】：由于細(xì)胞種類和實(shí)驗(yàn)體系不同，Rhodamine123工作液濃度和孵育時(shí)間可以根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)或參考文獻(xiàn)自行調(diào)整。4、用流式細(xì)胞儀檢測。

四、實(shí)驗(yàn)案例1、取對數(shù)生長期A549細(xì)胞接于六孔板（1*106+2mlDMEM培養(yǎng)基）,37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)4-24h待其貼壁，以便后續(xù)實(shí)驗(yàn)操作.2、棄掉培養(yǎng)液，PBS洗滌兩次.3、用培養(yǎng)基（無血清）稀釋Rh123母液制備1～20μMRh123工作液。具體工作濃度取決于細(xì)胞類型和細(xì)胞濃度。4、將Rh123工作液加入六孔板并在37℃下孵育30分鐘.5、去除Rh123工作液并用PBS洗滌三次細(xì)胞去除背景色.6、熒光顯微鏡觀察. 顯微鏡熒光染料DIL