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MSI和dMMR檢測的臨床應(yīng)用

?實體瘤免疫(PD-1和CTLA-4)患者的選擇

?2017年5月23日，美國FDA批準(zhǔn)了默克公司的Keytruda（pembrolizumab）應(yīng)用于高度微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（MSI-H）或錯配修復(fù)缺陷（dMMR）的實體liu患者

?2017年8月1日，F(xiàn)DA批準(zhǔn)百時美施貴寶的Opdivo（nivolumab）可應(yīng)用于***氟嘧啶，奧沙利鉑和伊立替康***后疾病進(jìn)展的MSI-H或dMMR的轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸liu患者

?MSI和dMMR的傳統(tǒng)臨床應(yīng)用

?用于結(jié)直腸liu和子宮內(nèi)膜liu患者林奇綜合征（HNPCC）的篩查（98%美國臨床實驗室）

?用于結(jié)直腸liu患者的預(yù)后指標(biāo)，MSI-H患者預(yù)后較好（美國臨床實驗室占48%）

?作為結(jié)直腸liu患者輔助化療(5-FU和Irinotecan)的用藥指導(dǎo) 邁杰轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)同時擁有符合GMP和ISO 13485的要求的GMP生產(chǎn)車間及倉儲，可以充分滿足客戶的需求。江蘇推薦dMMR抗體檢測試劑誠信合作

    MSI屬于一種基因水平的變異現(xiàn)象，而背后的根源則是錯配修復(fù)蛋白功能缺失。故無論從蛋白水平檢測MLH1、MSH2、MSH6、PMS2等分子，還是在基因水平檢測MSI狀態(tài)均有助于判斷該類病因?，F(xiàn)已證明二者的符合性達(dá)到。然而由于人們首先在結(jié)直腸ai中認(rèn)識了微衛(wèi)星不穩(wěn)定現(xiàn)象，并且將結(jié)直腸ai被分為MSI-H（MSI高度不穩(wěn)定）型和MSS（微衛(wèi)星穩(wěn)定型）以區(qū)別其在預(yù)后與***方面的差異。早期的檢測方法為通過對Bat26、Bat25、D5S346、D2S123和D17S250五個微衛(wèi)星位點的檢測，根據(jù)其存在MSI的數(shù)量將結(jié)直腸ai分為MSI-H（具有兩個和兩個以上的位點改變）、MSI-L（只有一個位點發(fā)生改變）和微衛(wèi)星穩(wěn)定型(MSS)。MSI-L型在臨床表現(xiàn)上與MSS**無明顯差別，通常被歸為MSS**。隨后當(dāng)人們認(rèn)識到為星星不穩(wěn)定現(xiàn)象源于錯配修復(fù)系統(tǒng)功能缺陷，并且對其機(jī)制研究透徹之后逐漸形成通過對錯配修復(fù)蛋白的檢測來確定MSI的方法，即錯配修復(fù)蛋白免疫組織化學(xué)檢測。免疫組織化學(xué)的方法具有方便、快捷、穩(wěn)定等優(yōu)點并且對Lynch綜合征的確診具有指向性，因此被***接收，目前已幾乎替代前者。上述MSI的傳統(tǒng)檢測方法不能用于對Lynch綜合征的確診，而免疫組織化學(xué)方法因直接檢測相關(guān)蛋白對Lynch綜合征具有***的指向性。山西提供dMMR抗體檢測試劑鄭重承諾邁杰轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)為客戶提供生物標(biāo)記物發(fā)現(xiàn)、 靶點驗證、伴隨診斷開發(fā)與商業(yè)化、患者用藥指導(dǎo)等一體化解決方案。

    RAF***對多種**的發(fā)生、發(fā)展產(chǎn)生重要影響，RAF突變以BRAF常見，BRAF是RAS-RAF-MAPK信號通路的重要基因，BRAF突變常見于V600E位點，其在結(jié)腸ai的突變率為。BRAF突變的ai癥患者中右半結(jié)腸ai占95%，在BRAF野生型的ai癥患者中右半結(jié)腸ai患者占48%。研究發(fā)現(xiàn)在右半結(jié)腸aiBRAF突變率為，左半結(jié)腸ai、直腸ai的突變率分別為、。BRAF突變與右半結(jié)腸ai相關(guān)，并且BRAF基因突變和位置有***的線性相關(guān)關(guān)系，隨著**位置由升結(jié)腸移至直腸，BRAF的突變率由40%降至不到。2.預(yù)測EGFR***作用NicolantonioF等人對113例Cetuximab耐藥的轉(zhuǎn)移性結(jié)腸ai患者進(jìn)行了檢測，發(fā)現(xiàn)對這兩種藥物耐受的患者，有30%~40%存在KRAS突變，而野生型的KRAS患者中有14%發(fā)生BRAFV600E突變。BRAF突變者對這兩種藥存在耐藥，且生存率較其它患者明顯降低。但一項關(guān)于CRYSTAL和OPUS試驗的meta分析發(fā)現(xiàn)BRAF突變似乎不影響西妥昔單抗的療效，**是一個重要的預(yù)后指標(biāo)。3.預(yù)測預(yù)后無論是早期還是晚期轉(zhuǎn)移CRC，BRAF突變狀態(tài)都是較強(qiáng)的生存預(yù)測因素，與KRAS基因突變相比，BRAF基因突變常見于尚未發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的結(jié)腸ai，以Ⅱ、Ⅲ期CRC患者多見，BRAF突變型CRC的惡性程度高、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率和局部晚期發(fā)生率高。

    結(jié)直腸ai是常見的消化道惡性liu，在我國，特別是在現(xiàn)代化發(fā)展迅速的大都市里，結(jié)直腸ai發(fā)病率的上升趨勢更為明顯。染色體不穩(wěn)定(chromosomalinstability，CIN)途徑和微衛(wèi)星不穩(wěn)定(microsatelliteinstability，MSI)途徑是結(jié)直腸ai發(fā)生的兩條主要分子途徑。前者占散發(fā)性結(jié)直腸ai的75％，絕大多數(shù)存在APC基因的突變和染色體18q的缺失，并有較高比例的KRAS和p53基因突變，好發(fā)于左半結(jié)腸，組織學(xué)類型以高、中分化為主。后者占散發(fā)性結(jié)直腸ai的15％，多見于右半結(jié)腸，組織學(xué)類型以黏液腺ai和低分化腺ai為常見，而且?guī)缀跛械腖ynch綜合征相關(guān)性結(jié)直腸ai均通過MSI途徑發(fā)生。更為重要的是，MSI結(jié)直腸ai不*在好發(fā)部位、常見組織形態(tài)上與CIN結(jié)直腸ai存在差異，而且在臨床預(yù)后、***、遺傳性liu篩查方案的選擇上也有所不同，因此必須在臨床工作中將其區(qū)分開來。本文主要就MSI結(jié)直腸ai、Lynch綜合征的病理特點、發(fā)生機(jī)制、篩查策略及其臨床意義做一論述。一、DNA錯配修復(fù)(mismatchrepair)系統(tǒng)與MSI結(jié)直腸ai錯配修復(fù)系統(tǒng)的功能是糾正DNA復(fù)制過程出現(xiàn)的錯誤，確保復(fù)制過程的“保真性”。錯配修復(fù)蛋白包括MutS和MutL兩大家族，前者包括MSH2／MSH3和MSH6等，后者包括MLH1、MLH3、PMS1和PMS2。邁杰轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)旨在發(fā)現(xiàn)或驗證有臨床轉(zhuǎn)化價值的新靶點，揭示疾病發(fā)病，藥物作用，耐藥等新的生物學(xué)機(jī)制。

    微衛(wèi)星不穩(wěn)定），不推薦氟尿嘧啶類藥物的單藥輔助化療。四、PIK3CA/PIK3CB磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）是PI3K/AKT信號通路中的關(guān)鍵分子，PIK3CA/PIK3CB為PI3K的亞單位，研究表明其表達(dá)異常導(dǎo)致PI3K/AKT細(xì)胞信號通路的異常，在結(jié)直腸ai的發(fā)***展中有重要的作用，其還與MDR1、MRP1介導(dǎo)的多藥耐藥存在密切聯(lián)系。1.預(yù)測西妥昔單抗療效有多項臨床回顧性研究證明PIK3CA基因突變狀態(tài)與西妥昔單抗的療效密切相關(guān)，PIK3CA基因突變的患者，西妥昔單抗療效低，反之療效高，但PI3KCA在西妥昔單抗靶向***大腸ai中的具體調(diào)控機(jī)制尚不清楚。2.評估預(yù)后2014年KishikiT等發(fā)現(xiàn)在KRAS野生型的結(jié)直腸ai患者中，攜帶PIK3CA突變的患者疾病控制率較低，PFS較野生型患者短（HR：；95%CI：；P＜），OS也較野生型短（HR：；95%CI：；P＜）。另外一項發(fā)表在JCancerResClinOncol對839名接受抗EGFR***的mCRC病人的Meta分析研究發(fā)現(xiàn)，攜帶PIK3CA突變的患者PFS更短。因此PIK3CA與大腸ai發(fā)***展及多藥耐藥性具有密切關(guān)系，其高表達(dá)不*會導(dǎo)致傳統(tǒng)化療耐藥，并且與EGFR靶向***密切相關(guān)。其高表但仍有許多難題有待克服，特別是針對PIK3CA、PIK3CB突變、耐藥等機(jī)制的研究。邁杰轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)分子平臺可以基于成熟的qPCR技術(shù)定量檢測外源載體拷貝數(shù)，應(yīng)用于藥物分布實驗如CAR-T等。貴州dMMR抗體檢測試劑來電咨詢

邁杰轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)蛋白免疫產(chǎn)品開發(fā)平臺可提供基于IHC平臺的體外診斷試劑盒以及蛋白抗體原料一站式開發(fā)服務(wù)。江蘇推薦dMMR抗體檢測試劑誠信合作

    切片或放入4℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩Ｐ奁筮M(jìn)行連續(xù)切片，厚度定為3μm，將連續(xù)切片漂在涼水中,讓其自然展開，再將分開的切片轉(zhuǎn)移到45℃的溫水中展片30秒，用經(jīng)多聚賴氨酸處理過的載玻片裱貼切片，將制成的組織芯片放入65℃烤箱內(nèi)烤片2小時，取出室溫冷卻，放入-4℃冰箱保存。二、ihc染色及分析常規(guī)二甲苯脫蠟3次，每次6分鐘，100％、100％、95％、95％、85％梯度乙醇中水化，每次3分鐘，***自來水沖洗。進(jìn)行抗原修復(fù)，然后將切片放入濕盒中，pbs沖洗3×3分鐘。滴加3％h2o2孵育10分鐘，pbs沖洗3×3分鐘。甩去pbs，滴加過氧化物酶阻斷劑室溫孵育10分鐘。甩干切片，滴加適當(dāng)比例稀釋的一抗(***稀釋根據(jù)抗體濃度來設(shè)計抗體的稀釋比例)室溫(25℃)孵育1小時，pbs沖洗3×3分鐘，滴加二抗室溫孵育30分鐘，pbs沖洗3×3分鐘，甩去pbs，用新鮮配置的dab顯色液顯色3-10分鐘。蘇木素復(fù)染20秒，pbs返藍(lán)。按照85％(3分鐘)、95％(3分鐘)、95％(3分鐘)、100％(3分鐘)、100％(3分鐘)的酒精梯度依次脫水，***兩次二甲苯透明10分鐘，中性樹膠封片。免疫組化染色結(jié)果分為：陽性和陰性。陽性表達(dá)必須在細(xì)胞和組織特定的抗原部位才能視為陽性。在組織染色分布清晰及細(xì)胞定位準(zhǔn)確的情況下。江蘇推薦dMMR抗體檢測試劑誠信合作