加藥時間:由于基因轉(zhuǎn)染到細胞內(nèi)之后要一段時間才能表達出蛋白質(zhì)。所以篩選不能太早；但是也不能太晚，因為轉(zhuǎn)染了外源基因的細胞代謝負荷較大，增值較慢，時間長了就會被沒有外源基因轉(zhuǎn)入的細胞所淹沒，終導致篩選不出陽性克隆，一般要在轉(zhuǎn)染24小時之后才開始加G418篩選。隨著細胞的代謝G418的濃度和活性都回下降，所以每3~5天都要更換一次含有G418的篩選液。這時藥物濃度可以降至200ug/ml。培養(yǎng)液:加藥篩選約6天左右，細胞會大量死亡，孔中只剩下的細胞。這時會出現(xiàn)兩個問題：1.死亡的細胞會裂解釋放出有害物質(zhì)，導致那些有neo表達的陽性細胞死亡，即非選擇性死亡。2.孔中細胞數(shù)目很少，細胞之間的信號會變得很弱，也會導致陽性細胞的狀態(tài)不佳甚至死亡。這個時候需要一種特殊的培養(yǎng)液：假如你要轉(zhuǎn)染3T3細胞，在3T3細胞匯合度達到80%的時候，換液，培養(yǎng)過夜之后收集培養(yǎng)液，通過濾器消毒，和新鮮的培養(yǎng)液按1：1混合備用。再轉(zhuǎn)染后篩選過程中就可以應用這種培養(yǎng)基。DC細胞誘導：胞形態(tài)，至細胞毛刺樣突起，有典型DC形態(tài)懸浮細胞。標準葡萄糖溶液(1mg/ml)
淋巴細胞亞群及其功能：T淋巴細胞及其分類主要應用抗T細胞表面抗原McAb.根據(jù)T淋巴細胞表面分化抗原將成熟T細胞分為CD4+、CD8-和CD4-、CD8+兩大亞群，T淋巴細胞的功能與表現(xiàn)型之間的對應關系是相對的，其免疫活性可能受“微環(huán)境”的影響，并受MHC抗原的制約，許多研究證明，CD4+T細胞具有殺傷活性，介導Ι類抗原不相容時的靶細胞溶解。TU等研究表明，CD4+的細胞毒活性存在兩種完全不同的機理，并證明TH1和TH2的細胞毒活性不同。前者強，后者弱或無活性。Dennert等發(fā)現(xiàn)，克隆化的T淋巴細胞具有輔助，細胞毒活性和遲發(fā)型超敏反應作用，這種功能的多樣性有賴于所采用的分析方法。CD4+細胞識別Ι類MHC抗原，其效應的發(fā)揮也受Ι類抗原的制約；CD3+細胞識別Ι類MHC抗原，發(fā)揮免疫效應也受其控制。丙基紅指示劑(4.6-6.6)稀釋過的血液樣本小心鋪到Ficoll分離液上面。
穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞的篩選：1、轉(zhuǎn)染48 h后，用含適當濃度的潮霉素B篩選培養(yǎng)基來傳代細胞（直接傳代或者稀釋后傳代）。注意：細胞處于活躍分裂狀態(tài)時的殺傷效果較好。但細胞過于稠密，其效率會降低，較好將細胞稀釋至豐度低于25%。2、每隔3-4天更換含有藥物的篩選培養(yǎng)液。3、篩選7天后觀察并評估細胞克?。洌┑男纬汕闆r。集落的形成可能還需要一周或者更多的時間（取決于宿主細胞類型，轉(zhuǎn)染，以及篩選效果）。4、挑取并轉(zhuǎn)移5-10個抗性克隆于35mm細胞培養(yǎng)板，繼續(xù)用含藥物的篩選培養(yǎng)液維持培養(yǎng)7天。5、后續(xù)更換正常培養(yǎng)基培養(yǎng)即可。
亞甲基藍染色液(1%)使用說明 貨號：G1303 規(guī)格：100ml 保存：室溫，避光，12 個月。 產(chǎn)品說明： 亞甲基藍(Methylene blue)又稱美藍、次甲基藍、次甲藍等，是一種芳香雜環(huán)化合物。含水 亞甲基藍的分子式為 C16H24ClN3O3S，分子量為 373.9，CAS 號為 7220-79-3。亞甲基藍染色 液常用于絲綢、紙張、細菌、細胞等染色。因其容易氧化，染色結(jié)果不宜長久保存。 操作說明：（光供參考） 1、 樣品處理 （1） （2） （3） 對于石蠟切片：常規(guī)脫蠟復水。 對于冰凍切片：蒸餾水 2min。 對于培養(yǎng)細胞：先用 4%多聚甲醛固定，然后蒸餾水洗滌 2min，較后 換用新鮮的蒸餾水，再洗滌 2min。 2、 美藍染色 （1） （2） 染色結(jié)果： Methylene blue Stain(1%)染色。 用蒸餾水或自來水充分洗滌，進行觀察和拍照。 組織或細胞 藍色 注意事項： 1、 開始次使用本試劑時建議先取 1～2 個樣品做預實驗。 2、 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。淋巴細胞分離液是一種根據(jù)細胞密度差異，借助離心產(chǎn)生的重力加速度，進行細胞的分離純化的常用試劑。
使用方法：1， 固定細胞或組織樣品，經(jīng)過固定后，適當洗滌除去固定劑。如果需要進行免疫熒光染色，可先進行免疫熒光染色，染完畢后再進行染色。如果不需要進行其它染色，則直接進行染色。 2， 對于貼壁細胞或組織切片，加入少量染色液，覆蓋住樣品即可。對于懸浮細胞，至少加入待染色樣品體積 3 倍的染色液，混勻。 3， 室溫染色 5-10 分鐘。 4， 吸除染色液，生理鹽水洗滌 2-3 次，每次 3-5 分鐘。 5， 置于熒光顯微鏡下觀察，激發(fā)波長 360-400nm。 溶液注意事項： dapi 被普遍認為具有致性，操作時應戴手套，并避免交叉污染。 本產(chǎn)品需避光，并盡量避免反復凍融。熒光染料都存在淬滅問題，建議染色后盡量當天完成檢測。 為減緩熒光淬滅可以使用抗熒光衰減封片劑。丁胺卡那霉素給藥說明：長期用藥可能導致耐藥菌過度生長。茜素黃R指示劑(1.9-3.3,10.1-12.1)
科研實驗中試劑取用應注意事項：當向量筒中傾倒液體接近所需刻度時，停止傾倒。標準葡萄糖溶液(1mg/ml)
潮霉素 B(Hygromycin B) 是一種由吸水鏈霉菌產(chǎn)生的，能夠克制細菌、菌類和 一些高等真核生物細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)生物合成來。潮霉素 B 屬于是氨基糖苷類，通過 克制蛋白質(zhì)的合成來阻止微生物生長，對原核細胞與真核細胞都是克制作用。 Leagene Hygromycin B solution 常用于轉(zhuǎn)基因?qū)嶒灥目剐院Y選，篩選具有潮霉素 B 的抗性基因。 產(chǎn)品組成： 編號 名稱 CA0012 CA0012 Storage Hygromycin B solution (50mg/ml) 使用說明書 10ml 20ml 1份 4℃ 避光 操作步驟(光供參考)： 1、 根據(jù)實驗具體要求操作。 2、 一般植物細胞篩選濃度在 20～200μ g/ml，動物細胞篩選濃度 50～1000μ g/ml，應根 據(jù)具體實驗選擇較佳篩選濃度。標準葡萄糖溶液(1mg/ml)