Western抗體洗脫液(強(qiáng)堿性)

試劑盒實(shí)驗(yàn)遇到復(fù)孔該怎么辦。在設(shè)計(jì)復(fù)孔檢查時(shí)，提出問(wèn)題：是對(duì)同一個(gè)樣品作兩次稀釋，再別離加到板上的兩個(gè)孔，仍是只稀釋一次，然后羅致兩次別離加到兩個(gè)孔？前者好像把稀釋時(shí)的過(guò)錯(cuò)也考慮到了，但做出來(lái)的成果兩個(gè)孔相關(guān)挺大的。在實(shí)驗(yàn)中設(shè)復(fù)孔，意圖是為了削減本次實(shí)驗(yàn)的體系過(guò)錯(cuò)對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)帶來(lái)的影響，所以應(yīng)該用第二種，有條件的話復(fù)孔的數(shù)量能夠添加，體系過(guò)錯(cuò)更小。選用后者。假定在實(shí)驗(yàn)室階段，或許需求屢次稀釋，然后將不同稀釋次數(shù)的別離做復(fù)孔，以便檢查稀釋進(jìn)程中帶來(lái)的過(guò)錯(cuò)；假定同一次稀釋的復(fù)孔一起的存在檢測(cè)差異大，或許板的均一性存在必定問(wèn)題（打掃操作因素）。假定不同稀釋次數(shù)差異大，闡明稀釋方法有問(wèn)題。注意事項(xiàng)：避免反復(fù)凍融。Western抗體洗脫液(強(qiáng)堿性)

弱酸-弱堿型緩沖溶液的構(gòu)成與配制。這類緩沖溶液的組成為：弱酸+弱酸鹽（即共軛堿）、弱堿+弱堿鹽（即共軛酸）。常見的實(shí)例有：HAc-NaAc、HAc-NH4Ac（微酸性）、NH4Cl-NH3.這類緩沖溶液的實(shí)驗(yàn)室配制方法一般是根據(jù)溶液組成和濃度要求，直接稱取或量取弱酸、弱酸鹽溶液或弱堿、弱堿鹽溶液來(lái)配制。其實(shí)，這類緩沖溶液還可以用強(qiáng)酸與弱堿、強(qiáng)堿與酸來(lái)配制，歸納起來(lái)，應(yīng)該有三種配制方法：（1）弱酸+弱酸鹽，弱堿+弱堿鹽例如，HAc-NaAc、NH4Cl-NH3（2）弱酸（過(guò)量）+強(qiáng)堿（適量），弱堿（過(guò)量）+強(qiáng)酸（適量）例如，HAc（過(guò)量）-NaOH（適量）、NH3（過(guò)量）-HCl（適量）。這類緩沖溶液需要的共軛堿（NaAc）或共軛酸（NH4Cl）是通過(guò)反應(yīng)后產(chǎn)生的。（3）弱酸鹽（過(guò)量）+強(qiáng)酸（不足量）或弱堿鹽（過(guò)量）+強(qiáng)堿（不足量）例如，NaAc（過(guò)量）+HCl（適量），NH4Cl（過(guò)量）+NaOH（適量）緩沖溶液需要的弱酸（HAc）或弱堿（NH3）則通過(guò)反應(yīng)后產(chǎn)生。PbN滴定液(0.05mol/L)磷酸緩沖鹽溶液具有鹽平衡。

殺滅曲線的建立：通過(guò)建立殺滅曲線（劑量反應(yīng)曲線），確定能夠殺死未轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞的較低濃度，從而篩選得到穩(wěn)定表達(dá)目的蛋白的細(xì)胞株。建立殺滅曲線至少選擇5個(gè)濃度。1、按照20-25%的細(xì)胞密度將未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞鋪在合適的培養(yǎng)板上，37℃，CO2過(guò)夜培養(yǎng)（需要更高密度，可增加接種量）。2、根據(jù)細(xì)胞類型，設(shè)定合適的濃度梯度。以哺乳動(dòng)物細(xì)胞為例，可設(shè)定50，100，250，500，750，1000μg/mL。3、第2天換用新鮮配制的含有相應(yīng)濃度藥物的培養(yǎng)基，每個(gè)濃度做三個(gè)平行孔。4、接下來(lái)每3-4天更換新的含藥物培養(yǎng)基。5、按照每2天進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)，來(lái)確定殺滅未轉(zhuǎn)染細(xì)胞的恰當(dāng)濃度。通常7-10天內(nèi)能夠殺死絕大多數(shù)細(xì)胞的較低濃度為篩選用的工作濃度。

淋巴細(xì)胞亞群及其功能：T淋巴細(xì)胞及其分類主要應(yīng)用抗T細(xì)胞表面抗原McAb.根據(jù)T淋巴細(xì)胞表面分化抗原將成熟T細(xì)胞分為CD4+、CD8-和CD4-、CD8+兩大亞群，T淋巴細(xì)胞的功能與表現(xiàn)型之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系是相對(duì)的，其免疫活性可能受“微環(huán)境”的影響，并受MHC抗原的制約，許多研究證明，CD4+T細(xì)胞具有殺傷活性，介導(dǎo)Ι類抗原不相容時(shí)的靶細(xì)胞溶解。TU等研究表明，CD4+的細(xì)胞毒活性存在兩種完全不同的機(jī)理，并證明TH1和TH2的細(xì)胞毒活性不同。前者強(qiáng)，后者弱或無(wú)活性。Dennert等發(fā)現(xiàn)，克隆化的T淋巴細(xì)胞具有輔助，細(xì)胞毒活性和遲發(fā)型超敏反應(yīng)作用，這種功能的多樣性有賴于所采用的分析方法。CD4+細(xì)胞識(shí)別Ι類MHC抗原，其效應(yīng)的發(fā)揮也受Ι類抗原的制約；CD3+細(xì)胞識(shí)別Ι類MHC抗原，發(fā)揮免疫效應(yīng)也受其控制。檢測(cè)試劑盒安全性：試劑應(yīng)按標(biāo)簽說(shuō)明書儲(chǔ)存，使用前恢復(fù)到室溫。

檢測(cè)方法的三大特點(diǎn)：穩(wěn)定性好：包被的抗原的穩(wěn)定性可使試劑盒的效期得到確保，早期以合成肽為包被抗原的試劑盒效期只有3-4個(gè)月，選用基因工程抗原后效期很大程度延長(zhǎng)了?；蚬こ炭乖瓕⑻禺愋钥乖瓫Q定簇基因融合表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物包含更多的抗原決定簇，可提高試劑盒的靈敏度，提高檢出率。分子量大：合成肽選用化學(xué)辦法制備，因?yàn)楣に嚨南拗?，合成?shù)量有限，只能達(dá)到數(shù)百個(gè)氨基酸。而使用基因工程制備的抗原，分子量更大。用EDTA2K離心搜集在真空血液搜集管中的血液，5,000×g，15分鐘，4℃，分離血漿樣品，然后儲(chǔ)存在零下80℃直到使用。檢測(cè)試劑盒稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶。植物根系活力檢測(cè)試劑盒(萘胺比色法)

PH電極的保護(hù)液，即 3mol/L的KCL溶液。Western抗體洗脫液(強(qiáng)堿性)

當(dāng)往某些溶液中加入一定量的酸和堿時(shí)，有阻礙溶液pH變化的作用，稱為緩沖作用，這樣的溶液叫做緩沖溶液。弱酸及其鹽的混合溶液(如HOAc與NaOAc)，弱堿及其鹽的混合溶液(如NH3·H2O與NH4Cl)等都是緩沖溶液。由弱酸HA及其鹽NaA所組成的緩沖溶液對(duì)酸的緩沖作用，是由于溶液中存在足夠量的堿A-的緣故。當(dāng)向這種溶液中加入一定量的強(qiáng)酸時(shí)，H+離子基本上被A-離子消耗:所以溶液的pH值幾乎不變;當(dāng)加入一定量強(qiáng)堿時(shí)，溶液中存在的弱酸HA消耗OH-離子而阻礙pH的變化。Western抗體洗脫液(強(qiáng)堿性)