徐州昆明細胞高效轉(zhuǎn)染試劑

細胞電轉(zhuǎn)染實驗的幾點建議：1.電場強度要合適合適的電場強度對于電轉(zhuǎn)染實驗非常重要，電場強度不能過高，過高會增加細胞的死亡率；也不能過低，過低不能增加膜的通透性或在膜上形成小孔。不同細胞系具有不同的較佳場強值，實驗前應測定所轉(zhuǎn)染細胞系的較佳電場強度。2.細胞狀態(tài)要好用于電轉(zhuǎn)的細胞一般選取處于對數(shù)生長期的細胞（15代以內(nèi)，傳代后2d）。因為處于對數(shù)生長期的細胞分裂旺盛，表面結(jié)構致密比穩(wěn)定期的細胞差，電轉(zhuǎn)后，細胞膜的恢復能力強，而且處于有絲分裂期的細胞更容易接受外源DNA.在一般實驗室中很難普及。其它物理和化學介導的轉(zhuǎn)染方法，則各有其特點。徐州昆明細胞高效轉(zhuǎn)染試劑

影響轉(zhuǎn)染試驗的因素：細胞狀態(tài)變化：（1）轉(zhuǎn)染試劑與細胞不匹配細胞轉(zhuǎn)染較適合的不是原代細胞，也不是傳代很多次的細胞。這是因為細胞培養(yǎng)在實驗室中保存數(shù)月和數(shù)年后會經(jīng)歷突變，總?cè)旧w重組或基因調(diào)控變化等而演化。這會導致和轉(zhuǎn)染相關的細胞行為的變化。較適合轉(zhuǎn)染的細胞是經(jīng)過幾次傳代后達到對數(shù)生長期的細胞，細胞生長旺盛，較容易轉(zhuǎn)染。（2）把握時機沒錯！轉(zhuǎn)染也有適當?shù)臅r機，相比較非分裂細胞——分裂細胞往往要比靜止細胞更易于攝取并表達外源DNA。因此對大多數(shù)轉(zhuǎn)染操作而言，細胞都在轉(zhuǎn)染當天或前現(xiàn)在種板。同樣重要的是細胞在種板進行轉(zhuǎn)染時不應處于過度生長的狀態(tài)，如細胞數(shù)量過多，互相疊加，營養(yǎng)物質(zhì)耗竭，代謝廢物積聚，轉(zhuǎn)染率低下也是很正常的！杭州太原細胞高效轉(zhuǎn)染試劑對于原代細胞，可用促有絲分裂刺激物進行細胞活化。

細胞轉(zhuǎn)染實驗簡介實驗步驟：1、細胞傳代(1)試驗準備：200ul/1mlTip頭各一盒(以上物品均需高壓滅菌)，酒精棉球，廢液缸，試管架，微量移液器，記號筆，培養(yǎng)皿，離心管。(2)棄掉培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基，用1ml的PBS溶液洗滌兩次。(3)用Tip頭加入1mlTrypsin液，消化1分鐘(37。C，5%CO2)。用手輕拍培養(yǎng)瓶壁，觀察到細胞完全從壁上脫落下來為止。(4)加入1ml的含血清培養(yǎng)基終止反應。(5)用頭多次吹吸，使細胞完全分散開。(6)將培養(yǎng)液裝入離心管中，1000rpm離心5min。(7)用培養(yǎng)液重懸細胞，細胞計數(shù)后選擇0.8X106個細胞加入一個35mm培養(yǎng)皿。(8)將合適體積完全培養(yǎng)液加入離心管中，混勻細胞后輕輕加入培養(yǎng)皿中，使其均勻分布。(9)將培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，第二天轉(zhuǎn)染。

細胞轉(zhuǎn)染的注意事項：物品(PS)物品，比如青霉素和鏈霉素，是影響轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)基添加物。這些物品一般對于真核細胞無毒，但陽離子脂質(zhì)體試劑增加了細胞的通透性，使物品可以進入細胞。這降低了細胞的活性，導致轉(zhuǎn)染效率低。所以，在轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中不能使用物品，甚至在準備轉(zhuǎn)染前進行細胞鋪板時也要避免使用物品。這樣，在轉(zhuǎn)染前也不必潤洗細胞。對于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，不要在選擇性培養(yǎng)基中使用青霉素和鏈霉素，ICIN選擇性物品的競爭性克制劑。另外，為了保證無血清培養(yǎng)基中細胞的健康生長，使用比含血清培養(yǎng)基更少的物品量細胞轉(zhuǎn)染是完成這一過程的必需步驟。

細胞轉(zhuǎn)染的常用方法：磷酸鈣共沉淀原理：該法可用于瞬時或穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。然而因其對pH、溫度和緩沖液鹽濃度的微小變化十分敏感，所得結(jié)果容易出現(xiàn)差異，且對許多類型的細胞培養(yǎng)物(尤其是原代細胞)具有細胞毒性，轉(zhuǎn)染效率較差。實驗步驟：將核酸與氯化鈣在磷酸鹽緩沖液中混合，同時控制好pH、溫度等條件→室溫孵育，生成濃縮DNA的極小不溶性顆粒沉淀→將顆粒型沉淀分散到細胞中，促進DNA粘附在細胞表面→共沉淀通過內(nèi)吞作用進入胞漿→分析細胞瞬時基因表達或者選擇穩(wěn)定性傳染。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法陽離子脂質(zhì)體表面帶正電荷。青島細胞高效轉(zhuǎn)染試劑廠家供應

當復合物接近細胞膜時，通過內(nèi)吞作用形成內(nèi)體進入細胞。徐州昆明細胞高效轉(zhuǎn)染試劑

細胞轉(zhuǎn)染的常用方法：人工脂質(zhì)體法原理：帶正電的脂質(zhì)體與核酸帶負電的磷酸基團形成復合物，進而可被細胞內(nèi)吞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染/瞬時性轉(zhuǎn)染。這種方法幾乎適用于所有細胞，轉(zhuǎn)染效率高、重復型好，但轉(zhuǎn)染時需要去除血清，轉(zhuǎn)染效果隨細胞類型變化大。實驗步驟：在單獨試管中分別稀釋核酸及轉(zhuǎn)染試劑→脂質(zhì)體與核酸的磷酸骨架結(jié)合，形成復合物→脂質(zhì)體上的正電荷有助于復合物與細胞膜結(jié)合→復合物通過內(nèi)吞作用進入胞漿→分析細胞瞬時基因表達或沉默情況。徐州昆明細胞高效轉(zhuǎn)染試劑