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聚合酶鏈反應(yīng)：多重連接依賴探針擴增（MLPA):允許用單個引物對擴增多個靶標，從而避免多重PCR的分辨率限制。多重聚合酶鏈反應(yīng):由單個PCR混合物中的多個引物組組成，以產(chǎn)生對不同DNA序列特異的不同大小的擴增子。通過同時靶向多個基因，可以從單次測試中獲得額外的信息，否則將需要幾次試劑和更多時間來執(zhí)行。每個引物組的退火溫度必須優(yōu)化，以在單個反應(yīng)中正確工作，并符合擴增子尺寸。也就是說，當通過凝膠電泳可視化時，它們的堿基對長度應(yīng)該足夠不同以形成不同的條帶。聚合酶鏈式反應(yīng)中的DMSO、甘油等，主要用來保持酶的活性和幫助DNA解除纏繞結(jié)構(gòu)。徐州骨頭定量PCR網(wǎng)站

聚合酶鏈式反應(yīng)的常見問題：靶序列變異：如靶序列發(fā)生突變或缺失，影響引物與模板特異性結(jié)合，或因靶序列某 段缺失使引物與模板失去互補序列，其PCR擴增是不會成功的。假陽性：出現(xiàn)的PCR擴增條帶與目的靶序列條帶一致，有時其條帶更整齊，亮度更高。引物設(shè)計不合適：選擇的擴增序列與非目的擴增序列有同源性，因而在進行PCR擴增時，擴增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現(xiàn)假陽性。需重新設(shè)計引物。出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶：PCR擴增有時出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過多或酶的質(zhì)量差，dNTP濃度過高，Mg2+濃度過高，退火溫度過低，循環(huán)次數(shù)過多引起。其對策有：減少酶量，或調(diào)換另一來源的酶。②減少dNTP的濃度。適當降低Mg2+濃 度。增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。無錫骨頭PCR檢測技術(shù)網(wǎng)站逆轉(zhuǎn)錄酶將核糖核酸逆轉(zhuǎn)錄成cDNA ，然后通過聚合酶鏈反應(yīng)進行擴增。

聚合酶鏈式反應(yīng)的試驗污染：實驗室中克隆質(zhì)粒的污染：在分子生物學(xué)實驗室及某些用克隆質(zhì)粒做陽性對照的檢驗室，這個問題也比較常見。因為克隆質(zhì)粒在單位容積內(nèi)含量相當高，另外在純化過程中需用較多的用具及試劑，而且在活細胞內(nèi)的質(zhì)粒，由于活細胞的生長繁殖的簡便性及具有很強的生命力。其污染可能性也很大。污染的監(jiān)測：一個好的實驗室，要時刻注意污染的監(jiān)測，考慮有無污染是什么原因造成的污染，以便采取措施，防止和消除污染。重復(fù)性試驗。選擇不同區(qū)域的引物進行PCR擴增。

聚合酶鏈反應(yīng)的常見問題分析與解決方法：PCR產(chǎn)物量過少：退火溫度不合適。以2度為梯度設(shè)計梯度PCR反應(yīng)優(yōu)化退火溫度。DNA模板量太少。增加DNA模板量。PCR循環(huán)數(shù)不足。增加反應(yīng)循環(huán)數(shù)。引物量不足。增加體系中引物含量。延伸時間太短。以1 kb/min的原則設(shè)置延伸時間。變性時間過長。變性時間過長會導(dǎo)致DNA聚合酶失活。DNA模板中存在抑制劑。確保DNA模板干凈。擴增產(chǎn)物在凝膠中涂布或成片狀條帶彌散：酶量過高。減少酶量；酶的質(zhì)量差，調(diào)換另一來源的酶。dNTP濃度過高。減少dNTP的濃度。電子聚合酶鏈反應(yīng)用于計算理論聚合酶鏈反應(yīng)結(jié)果。

聚合酶鏈式反應(yīng)的特點：靈敏度高：PCR產(chǎn)物的生成量是以指數(shù)方式增加的，能將皮克(pg=10-12）量級的起始待測模板擴增到微克（μg=-6）水平。能從100萬個細胞中檢出一個靶細胞；在病毒的檢測中，PCR的靈敏度可達3個RFU(空斑形成單位）；在細菌學(xué)中很小檢出率為3個細菌。簡便、快速：PCR反應(yīng)用耐高溫的Taq DNA聚合酶，一次性地將反應(yīng)液加好后，即在DNA擴增液和水浴鍋上進行變性-退火-延伸反應(yīng)，一般在2～4 小時完成擴增反應(yīng)。擴增產(chǎn)物一般用電泳分析，不一定要用同位素，無放射性污染、易推廣。純度要求低：不需要分離病毒或細菌及培養(yǎng)細胞，DNA 粗制品及RNA均可作為擴增模板。可直接用臨床標本如血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細胞、活組織等DNA擴增檢測。逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng))：用于從RNA中擴增DNA。南京實時RT-PCR檢測技術(shù)原理及步驟

聚合酶鏈式反應(yīng)中要確保反應(yīng)緩沖液融化完全并徹底混勻。徐州骨頭定量PCR網(wǎng)站

聚合酶鏈式反應(yīng)的試驗污染：PCR擴增產(chǎn)物污染：這是PCR反應(yīng)中很主要很常見的污染問題。因為PCR產(chǎn)物拷貝量大（一般為1013拷貝/ml），遠遠高于PCR檢測數(shù)個拷貝的極限，所以極微量的PCR產(chǎn)物污染，就可形成假陽性。還有一種容易忽視，很可能造成PCR產(chǎn)物污染的形式是氣溶膠污染。在空氣與液體面摩擦?xí)r就可形成氣溶膠，在操作時比較劇烈地搖動反應(yīng)管，開蓋時、吸樣時及污染進樣的反復(fù)吸樣都可形成氣溶膠而污染。據(jù)計算一個氣溶膠顆?？珊?8000拷貝，因而由其造成的污染是一個值得特別重視的問題。徐州骨頭定量PCR網(wǎng)站