南通實時PCR檢測技術設計公司

聚合酶鏈式反應準備：10×擴增緩沖液、4種dNTP混合物（終濃度）、引物（終濃度）、模板DNA、Taq DNA聚合酶、Mg2+（終濃度）、補加雙蒸水等。其中dNTP、引物、模板DNA、Taq DNA聚合酶以及Mg2+的加量（或濃度）可根據(jù)實驗調(diào)整，以上表格只提供大致參考值。PCR反應五要素：參加PCR反應的物質(zhì)主要有五種即：引物(PCR引物為DN段，細胞內(nèi)DNA復制的引物為一段RNA鏈）、酶、dNTP、模板和緩沖液（其中需要Mg2+）。引物有多種設計方法，由PCR在實驗中的目的決定，但基本原則相同。PCR的很大特點是能將微量的DNA大幅增加。南通實時PCR檢測技術設計公司

聚合酶鏈式反應：RNA和DNA的五碳糖，前者比后者多了一個O，由于多出來的O原子造成了RNA和DNA的堿基不同，即O原子造成U和T的不同，U分子化學式C4H4N2O2，T胸腺嘧啶化學式C5H6N2O2，現(xiàn)在將兩個分子式進行對比，U比T多了CH2，結合前面的核糖區(qū)別，還有一個O分子，其余結構相同，那么O和CH2之間的聯(lián)系是什么?是什么導致DNA和RNA的區(qū)別是RNA比DNA多了O和CH2？或者說如何將病毒的堿基中U變成DNA堿基中的T？若從結構上說，直接從U中加入一個CH2，得到了T，這里面介入化學鍵的斷裂和重組，但是這樣一來的話，即使U變成了T，但是核糖依舊是RNA比DNA多了一個O分子，只是此時結構是某分子=核糖（C4H9O4CHO）+堿基（A T G C），形成了RNA的五碳糖+DNA的堿基這種分子了。此時將這種分子導入受體細胞（亦或者蛋白質(zhì)）中，表達的性質(zhì)一定不同于病毒表達的性質(zhì)。珠海實時RT-PCR檢測技術方案逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應較廣用于表達譜，以確定基因的表達或鑒定RNA轉(zhuǎn)錄物的序列。

聚合酶鏈式反應準備：引物內(nèi)部不應出現(xiàn)互補序列。兩個引物之間不應存在互補序列，尤其是避免3 ′端的互補重疊。引物與非特異擴增區(qū)的序列的同源性不要超過70%，引物3′末端連續(xù)8個堿基在待擴增區(qū)以外不能有完全互補序列，否則易導致非特異性擴增。引物3‘端的堿基，特別是很末及倒數(shù)第二個堿基，應嚴格要求配對，很好選擇是G和C。引物的5′端可以修飾。如附加限制酶位點，引入突變位點，用生物素、熒光物質(zhì)、地高辛標記，加入其它短序列，包括起始密碼子、終止密碼子等。

聚合酶鏈反應注意事項：在實驗過程中要防止RNA的降解，保持RNA的完整性。在總RNA的提取過程中，注意避免mRNA的斷裂；為了防止非特異性擴增，必須設陰性對照；內(nèi)參的設定：主要為了用于靶RNA的定量。常用的內(nèi)參有G3PD（甘油醛-3-磷酸脫氫酶）、β-Actin（β-肌動蛋白）等。其目的在于避免RNA定量誤差、加樣誤差以及各PCR反應體系中擴增效率不均一各孔間的溫度差等所造成的誤差；PCR不能進入平臺期，出現(xiàn)平臺效應與所擴增的目的基因的長度、序列、二級結構以及目標DNA起始的數(shù)量有關。故對于每一個目標序列出現(xiàn)平臺效應的循環(huán)數(shù)，均應通過單獨實驗來確定；防止DNA的污染： 采用DNA酶處理RNA； 在可能的情況下，將PCR引物置于基因的不同外顯子，以消除基因和mRNA的共線性?，F(xiàn)在有些PCR因為擴增區(qū)很短，即使Taq酶活性不是很好也能在很短的時間內(nèi)復制完成。

PCR的反應條件：Tm=4（G+c）+（A+T），一般在45～55度，溫度低容易退火但特異性低；溫度高，不容易退火但特異性高。退火時間30秒。延伸溫度一般在70～75度這時TaqDNA聚合酶活性很高（150個/S），當引物在16個堿基以下時可采用緩慢升高溫度到70～75度的方法，使在低溫下就開始合成。一般<1KB時間1分鐘即可。當〈1KB時在較后的循環(huán)中延長擴增時間。循環(huán)次數(shù)25～30次。無產(chǎn)物時：取10ul擴增混合液作模板在進行PCR擴增；增加TaqDNA聚合酶濃度；增加循環(huán)次數(shù)；降低退火溫度；加靶DNA量。聚合酶鏈式反應中要確保反應緩沖液融化完全并徹底混勻。珠海實時RT-PCR檢測技術方案

聚合酶鏈式反應：模板的制備，PCR的模板可以是DNA，也可以是RNA。南通實時PCR檢測技術設計公司

聚合酶鏈反應：流聚合酶鏈反應:一種偽等溫PCR方法。將溶液置于熱梯度下，而不是反復加熱和冷卻聚合酶鏈反應混合物。由此產(chǎn)生的熱不穩(wěn)定性驅(qū)動對流流動自動將聚合酶鏈反應試劑從熱區(qū)域和冷區(qū)域打亂，從而反復啟動聚合酶鏈反應。通過利用混沌流場的出現(xiàn)，可以優(yōu)化熱邊界條件和PCR外殼的幾何形狀等參數(shù)，以產(chǎn)生特異和快速的PCR。這種對流聚合酶鏈反應設置明顯降低了設備功率需求和操作時間。逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應):用于從RNA中擴增DNA。逆轉(zhuǎn)錄酶將核糖核酸逆轉(zhuǎn)錄成cDNA ，然后通過聚合酶鏈反應進行擴增。逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應較廣用于表達譜，以確定基因的表達或鑒定RNA轉(zhuǎn)錄物的序列，包括轉(zhuǎn)錄起始和終止位點。如果基因的基因組DNA序列是已知的，逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應可以用來繪制基因中外顯子和內(nèi)含子的位置?；虻?’端(對應于轉(zhuǎn)錄起始位點)通常通過 RACE-PCR (快速擴增cDNA末端)中。南通實時PCR檢測技術設計公司