上海實時熒光定量PCR服務

聚合酶鏈式反應的特點：特異性強，PCR反應的特異性決定因素為：引物與模板DNA特異正確的結合；堿基配對原則；Taq DNA聚合酶合成反應的忠實性；靶基因的特異性與保守性。其中引物與模板的正確結合是關鍵。引物與模板的結合及引物鏈的延伸是遵循堿基配對原則的。聚合酶合成反應的忠實性及TaqDNA聚合酶耐高溫性，使反應中模板與引物的結合（復性）可以在較高的溫度下進行，結合的特異性增加，被擴增的靶基因片段也就能保持很高的正確度。再通過選擇特異性和保守性高的靶基因區(qū)，其特異性程度就更高。PCR的很大特點是能將微量的DNA大幅增加。上海實時熒光定量PCR服務

聚合酶鏈式反應的常見問題：出現(xiàn)非特異性擴增帶：PCR擴增后出現(xiàn)的條帶與預計的大小不一致，或大或小，或者同時出現(xiàn)特異性擴增帶 與非特異性擴增帶。非特異性條帶的出現(xiàn)，其原因：一是引物與靶序列不完全互補、或引物聚合形成二聚體。二是Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低，及PCR循環(huán)次數(shù)過多有關。其次是酶的質和量，往往一些來源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來源的酶則不出現(xiàn)，酶量過多有時也會出現(xiàn)非特異性擴增。其對策有：必要時重新設計引 物。減低酶量或調換另一來源的酶。降低引物量，適當增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。適當提高退火溫度或采用二溫度點法（93℃變性，65℃左右退火與延伸）。杭州骨頭Real-time PCR供應商聚合酶鏈式反應準備：PCR所用的酶主要有兩種來源：Taq和Pfu，分別來自兩種不同的噬熱菌。

聚合酶鏈反應：流聚合酶鏈反應:一種偽等溫PCR方法。將溶液置于熱梯度下，而不是反復加熱和冷卻聚合酶鏈反應混合物。由此產(chǎn)生的熱不穩(wěn)定性驅動對流流動自動將聚合酶鏈反應試劑從熱區(qū)域和冷區(qū)域打亂，從而反復啟動聚合酶鏈反應。通過利用混沌流場的出現(xiàn)，可以優(yōu)化熱邊界條件和PCR外殼的幾何形狀等參數(shù)，以產(chǎn)生特異和快速的PCR。這種對流聚合酶鏈反應設置明顯降低了設備功率需求和操作時間。逆轉錄聚合酶鏈反應(逆轉錄-聚合酶鏈反應):用于從RNA中擴增DNA。逆轉錄酶將核糖核酸逆轉錄成cDNA ，然后通過聚合酶鏈反應進行擴增。逆轉錄-聚合酶鏈反應較廣用于表達譜，以確定基因的表達或鑒定RNA轉錄物的序列，包括轉錄起始和終止位點。如果基因的基因組DNA序列是已知的，逆轉錄-聚合酶鏈反應可以用來繪制基因中外顯子和內含子的位置?；虻?’端(對應于轉錄起始位點)通常通過 RACE-PCR (快速擴增cDNA末端)中。

聚合酶鏈反應也可以用作以下敏感試驗的一部分組織分型，對移植至關重要。截至2008年，甚至有人提議用聚合酶鏈反應檢測取代傳統(tǒng)的血型抗體檢測。許多形式的病癥涉及致病基因的改變。通過使用基于聚合酶鏈反應的測試來研究這些突變，醫(yī)治方案有時可以根據(jù)患者的不同而不同。聚合酶鏈反應可以早期診斷惡性疾病，如白血病和淋巴瘤，這是目前病癥研究中發(fā)展很快的，并且已經(jīng)被常規(guī)使用。PCR檢測可以直接在基因組DNA樣品上進行，以檢測易位特異性惡性細胞，其靈敏度至少是其他方法的10，000倍。聚合酶鏈反應在醫(yī)學領域非常有用，因為它允許分離和擴增病癥抑制劑。例如，定量PCR可以用于量化和分析單細胞，以及識別DNA、mRNA和蛋白質的確認和組合。序列間特異性聚合酶鏈反應是一種用于DNA指紋識別的聚合酶鏈反應方法。

聚合酶鏈式反應的步驟：標準的PCR過程分為三步：DNA變性：（90℃-96℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下，氫鍵斷裂，形成單鏈DNA；退火：（60℃-65℃）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結合，形成局部雙鏈。延伸：（70℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右，活性很好）的作用下，以dNTP為原料，從引物的3′端開始以從5′→3′端的方向延伸，合成與模板互補的DNA鏈。每一循環(huán)經(jīng)過變性、退火和延伸，DNA含量即增加一倍?，F(xiàn)在有些PCR因為擴增區(qū)很短，即使Taq酶活性不是很好也能在很短的時間內復制完成，因此可以改為兩步法，即退火和延伸同時在60℃-65℃間進行。聚合酶鏈反應的試劑應分配到一次性的等分試樣中。寧波骨頭Real-time PCR原理

嵌套聚合酶鏈反應：通過減少DNA非特異性擴增的背景，提高DNA擴增的特異性。上海實時熒光定量PCR服務

聚合酶鏈式反應的試驗污染：PCR擴增產(chǎn)物污染：這是PCR反應中很主要很常見的污染問題。因為PCR產(chǎn)物拷貝量大（一般為1013拷貝/ml），遠遠高于PCR檢測數(shù)個拷貝的極限，所以極微量的PCR產(chǎn)物污染，就可形成假陽性。還有一種容易忽視，很可能造成PCR產(chǎn)物污染的形式是氣溶膠污染。在空氣與液體面摩擦時就可形成氣溶膠，在操作時比較劇烈地搖動反應管，開蓋時、吸樣時及污染進樣的反復吸樣都可形成氣溶膠而污染。據(jù)計算一個氣溶膠顆?？珊?8000拷貝，因而由其造成的污染是一個值得特別重視的問題。上海實時熒光定量PCR服務