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聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)：模板的制備，PCR的模板可以是DNA，也可以是RNA。模板的取材主要依據(jù)PCR的擴(kuò)增對象，可以是病原體標(biāo)本如病毒、細(xì)菌、菌類等。也可以是病理生理標(biāo)本如細(xì)胞、血液、羊水細(xì)胞等。法醫(yī)學(xué)標(biāo)本有血斑、精斑、毛發(fā)等。標(biāo)本處理的基本要求是除去雜質(zhì)，并部分純化標(biāo)本中的核酸。多數(shù)樣品需要經(jīng)過SDS和蛋白酶K處理。難以破碎的細(xì)菌，可用溶菌酶加EDTA處理。所得到的粗制DNA，經(jīng)酚、氯仿抽提純化，再用乙醇沉淀后用作PCR反應(yīng)模板。流聚合酶鏈反應(yīng)：一種偽等溫PCR方法。珠海實(shí)時RT-PCR檢測技術(shù)網(wǎng)站

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)準(zhǔn)備：PCR所用的酶主要有兩種來源：Taq和Pfu，分別來自兩種不同的噬熱菌。其中Taq擴(kuò)增效率高但易發(fā)生錯配。Pfu擴(kuò)增效率弱但有糾錯功能。所以實(shí)際使用時根據(jù)需要必須做不同的選擇。模板即擴(kuò)增用的DNA，可以是任何來源，但有兩個原則，純度必須較高，第二濃度不能太高以免抑制。緩沖液的成分很為復(fù)雜，除水外一般包括四個有效成分：緩沖體系，一般使用HEPES或MOPS緩沖體系；一價(jià)陽離子，一般采用鉀離子，但在特殊情況下也可使用銨根離子；二價(jià)陽離子，即鎂離子，根據(jù)反應(yīng)體系確定，除特殊情況外不需調(diào)整；輔助成分，常見的有DMSO、甘油等，主要用來保持酶的活性和幫助DNA解除纏繞結(jié)構(gòu)。徐州分子生物學(xué)RT-PCR檢測技術(shù)重疊延伸聚合酶鏈反應(yīng)用于連接含有基因、調(diào)節(jié)序列或突變的DN段。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的常見問題：Mg2+濃度：Mg2+離子濃度對PCR擴(kuò)增效率影響很大，濃度過高可降低PCR擴(kuò)增的特 異性，濃度過低則影響PCR擴(kuò)增產(chǎn)量甚至使PCR擴(kuò)增失敗而不出擴(kuò)增條帶。反應(yīng)體積的改變：通常進(jìn)行PCR擴(kuò)增采用的體積為20ul、30ul、50ul?；?00ul，應(yīng)用多 大體積進(jìn)行PCR擴(kuò)增，是根據(jù)科研和臨床檢測不同目的而設(shè)定，在做小體積如20ul 后，再做大體積時，一定要模索條件，否則容易失敗。物理原因：變性對PCR擴(kuò)增來說相當(dāng)重要，如變性溫度低，變性時間短，極有可能出現(xiàn)假陰性；退火溫度過低，可致非特異性擴(kuò)增而降低特異性擴(kuò)增效率退火溫度過高影響引物與模板的結(jié)合而降低PCR擴(kuò)增效率。有時還有必要用標(biāo)準(zhǔn)的溫度計(jì)，檢測一下擴(kuò)增儀或水溶鍋內(nèi)的變性、退火和延伸溫度，這也是PCR失敗的原因之一。

序列標(biāo)簽站點(diǎn)是一個過程，其中PCR被用作基因組的特定片段存在于特定克隆中的指示物。人類基因組計(jì)劃發(fā)現(xiàn)這一應(yīng)用對于繪制他們測序的粘?？寺∫约皡f(xié)調(diào)不同實(shí)驗(yàn)室的結(jié)果至關(guān)重要。聚合酶鏈反應(yīng)的一個令人興奮的應(yīng)用是對來自遠(yuǎn)古來源的DNA進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，例如在尼安德特人的復(fù)原骨骼中、從猛犸的冷凍組織中或從埃及木乃伊的大腦中發(fā)現(xiàn)的DNA已經(jīng)被放大和測序。]在某些情況下，這些來源的高度降解的DNA可能在擴(kuò)增的早期階段重新組裝。聚合酶鏈反應(yīng)的一個常見應(yīng)用是對以下基因表達(dá)模式的研究。組織(甚至單個細(xì)胞)可以在不同階段進(jìn)行分析，以了解哪些基因變得活躍，哪些基因被關(guān)閉。該應(yīng)用還可以使用定量聚合酶鏈反應(yīng)來定量表達(dá)的實(shí)際水平。聚合酶鏈反應(yīng)是一種非常強(qiáng)大和實(shí)用的研究工具。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)：1976年，中國科學(xué)家，發(fā)現(xiàn)了穩(wěn)定的Taq DNA聚合酶，為PCR技術(shù)發(fā)展也做出了基礎(chǔ)性貢獻(xiàn)。PCR是利用DNA在體外攝氏95°高溫時變性會變成單鏈，低溫（經(jīng)常是60°C左右）時引物與單鏈按堿基互補(bǔ)配對的原則結(jié)合，標(biāo)本核酸模板在提取過程中，由于吸樣污染導(dǎo)致標(biāo)本間污染；有些微生物標(biāo)本尤其是病毒可隨氣溶膠或形成氣溶膠而擴(kuò)散再調(diào)溫度至DNA聚合酶很適反應(yīng)溫度（72°C左右），DNA聚合酶沿著磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互補(bǔ)鏈。基于聚合酶制造的PCR儀實(shí)際就是一個溫控設(shè)備，能在變性溫度，復(fù)性溫度，延伸溫度之間很好地進(jìn)行控制。聚合酶鏈反應(yīng)的試劑應(yīng)分配到一次性的等分試樣中。徐州細(xì)胞PCR檢測技術(shù)方案

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的引物與模板的結(jié)合及引物鏈的延伸是遵循堿基配對原則的。珠海實(shí)時RT-PCR檢測技術(shù)網(wǎng)站

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的試驗(yàn)污染：實(shí)驗(yàn)室中克隆質(zhì)粒的污染：在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室及某些用克隆質(zhì)粒做陽性對照的檢驗(yàn)室，這個問題也比較常見。因?yàn)榭寺≠|(zhì)粒在單位容積內(nèi)含量相當(dāng)高，另外在純化過程中需用較多的用具及試劑，而且在活細(xì)胞內(nèi)的質(zhì)粒，由于活細(xì)胞的生長繁殖的簡便性及具有很強(qiáng)的生命力。其污染可能性也很大。污染的監(jiān)測：一個好的實(shí)驗(yàn)室，要時刻注意污染的監(jiān)測，考慮有無污染是什么原因造成的污染，以便采取措施，防止和消除污染。重復(fù)性試驗(yàn)。選擇不同區(qū)域的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。珠海實(shí)時RT-PCR檢測技術(shù)網(wǎng)站