淮安分子生物學RT-PCR檢測技術

聚合酶鏈式反應又稱多聚酶鏈式反應，是一項利用DNA雙鏈復制的原理，在生物體外復制特定DN段的核酸合成技術。透過這項技術，可在短時間內大量擴增目的基因，而不必依賴大腸桿菌或酵母菌等生物體。聚合酶鏈反應是是一種簡單，廉價和可靠的方法復制DN段，這個概念適用于現物學和相關科學的許多領域。 PCR可能是分子生物學中使用很較廣的技術。這種技術被用于生物醫(yī)學研究，犯罪取證和分子考古學。通常，PCR由一系列20-40次重復的溫度變化組成，稱為熱循環(huán)，每個循環(huán)通常由兩個或三個離散的溫度步驟組成。PCR的很大特點是能將微量的DNA大幅增加。淮安分子生物學RT-PCR檢測技術

聚合酶鏈式反應準備：PCR所用的酶主要有兩種來源：Taq和Pfu，分別來自兩種不同的噬熱菌。其中Taq擴增效率高但易發(fā)生錯配。Pfu擴增效率弱但有糾錯功能。所以實際使用時根據需要必須做不同的選擇。模板即擴增用的DNA，可以是任何來源，但有兩個原則，純度必須較高，第二濃度不能太高以免抑制。緩沖液的成分很為復雜，除水外一般包括四個有效成分：緩沖體系，一般使用HEPES或MOPS緩沖體系；一價陽離子，一般采用鉀離子，但在特殊情況下也可使用銨根離子；二價陽離子，即鎂離子，根據反應體系確定，除特殊情況外不需調整；輔助成分，常見的有DMSO、甘油等，主要用來保持酶的活性和幫助DNA解除纏繞結構。無錫分子生物學Real-time PCR供應商聚合酶鏈式反應的特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。

現在有些PCR因為擴增區(qū)很短，即使Taq酶活性不是很好也能在很短的時間內復制完成，因此可以改為兩步法，即退火和延伸同時在60℃-65℃間進行，以減少一次升降溫過程，提高了反應速度。檢測：PCR反應擴增出了高的拷貝數，下一步檢測就成了關鍵。熒光素（溴化乙錠，EB）染色凝膠電泳是很常用的檢測手段。電泳法檢測特異性是不太高的，因此引物兩聚體等非特異性的雜交體很容易引起誤判。但因為其簡捷易行，成為了主流檢測方法。近年來以熒光探針為的檢測方法，有逐漸取代電泳法的趨勢。

基于聚合酶鏈反應的遺傳(或脫氧核糖核酸)指紋圖譜協(xié)議的發(fā)展已在法醫(yī)學中得到較廣應用：遺傳指紋以其辨別力的形式，可以從世界上所有人群中獨特地區(qū)分任何一個人。微小的DNA樣本可以從犯罪現場，和比較的從嫌疑人那里，或者從DNA資料庫早期的證據或罪犯。這些測試的簡單版本通常用于在刑事調查中快速排除嫌疑人。幾十年前的犯罪證據可以被檢驗，確認或免責很初被定罪的人。脫氧核糖核酸指紋中較小的區(qū)別有助于親子鑒定，在親子鑒定中，一個人和他的近親相匹配。可以測試未知人類遺骸的DNA，并與可能的父母、兄弟姐妹或兒童進行比較。類似的測試可以用來確認被收養(yǎng)(或)孩子的親生父母。新生兒的實際生父也可以被確認(或排除)。PCR產物的電泳檢測時間一般為48h以內，有些很好于當日電泳檢測，大于48h后帶型不規(guī)則甚至消失。

PCR的反應條件：dNTP濃度過高會加快反應速度，但同時還可以增加堿基的錯誤摻入率。引物濃度過高會引起錯配和非特異性產物擴增。TaqDNA聚合酶濃度過高會引起錯配和非特異性產物擴增，低則合成產物量減少。TaqDNA聚合酶無校正功能，摻入錯誤率達2*E-4個核苷酸，一個30個循環(huán)的擴增反應0.1%-0.25%總錯誤率。在90～95度下可使整個基因組的DNA變性為單鏈。一般94～95度30～60s。時間過長使TaqDNA聚合酶失活和dNTP破壞增多。DNA很快冷卻到40～60度使引物和模板結合。引物長度在15～25時退火溫度。逆轉錄-聚合酶鏈反應較廣用于表達譜，以確定基因的表達或鑒定RNA轉錄物的序列。南通微量RT-PCR檢測技術技術服務

聚合酶鏈反應應經常使用帶有一次性柱塞和超長移液器吸頭的移液器?；窗卜肿由飳WRT-PCR檢測技術

聚合酶鏈式反應準備：引物內部不應出現互補序列。兩個引物之間不應存在互補序列，尤其是避免3 ′端的互補重疊。引物與非特異擴增區(qū)的序列的同源性不要超過70%，引物3′末端連續(xù)8個堿基在待擴增區(qū)以外不能有完全互補序列，否則易導致非特異性擴增。引物3‘端的堿基，特別是很末及倒數第二個堿基，應嚴格要求配對，很好選擇是G和C。引物的5′端可以修飾。如附加限制酶位點，引入突變位點，用生物素、熒光物質、地高辛標記，加入其它短序列，包括起始密碼子、終止密碼子等?；窗卜肿由飳WRT-PCR檢測技術

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