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聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)準(zhǔn)備：引物內(nèi)部不應(yīng)出現(xiàn)互補(bǔ)序列。兩個(gè)引物之間不應(yīng)存在互補(bǔ)序列，尤其是避免3 ′端的互補(bǔ)重疊。引物與非特異擴(kuò)增區(qū)的序列的同源性不要超過70%，引物3′末端連續(xù)8個(gè)堿基在待擴(kuò)增區(qū)以外不能有完全互補(bǔ)序列，否則易導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增。引物3‘端的堿基，特別是很末及倒數(shù)第二個(gè)堿基，應(yīng)嚴(yán)格要求配對(duì)，很好選擇是G和C。引物的5′端可以修飾。如附加限制酶位點(diǎn)，引入突變位點(diǎn)，用生物素、熒光物質(zhì)、地高辛標(biāo)記，加入其它短序列，包括起始密碼子、終止密碼子等。PCR產(chǎn)物的電泳檢測(cè)時(shí)間一般為48h以內(nèi)，有些很好于當(dāng)日電泳檢測(cè)，大于48h后帶型不規(guī)則甚至消失。南京骨頭PCR檢測(cè)技術(shù)網(wǎng)站

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)：Taq(水生棲熱菌)聚合酶耐熱DNA聚合酶的很好活性溫度約為75-80°C(167-176°F),盡管該酶通常使用72°C(162°F)的溫度。在該步驟中，DNA聚合酶通過從反應(yīng)混合物中添加在5’-至-3’方向上與模板互補(bǔ)的游離DNA鏈來合成與DNA模板鏈互補(bǔ)的新DNA鏈，在新生(伸長(zhǎng))DNA鏈的末端，將dNTPs的5'-磷酸基與3'-羥基縮合。延伸所需的精確時(shí)間取決于所使用的DNA聚合酶和要擴(kuò)增的DNA目標(biāo)區(qū)域的長(zhǎng)度。根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，在很好溫度下，大多數(shù)DNA聚合酶每分鐘聚合一千個(gè)堿基。在很好條件下(即，如果沒有限制底物或試劑的限制)，在每個(gè)延伸/延伸步驟中，DNA靶序列的數(shù)量加倍。隨著每一個(gè)連續(xù)的循環(huán)，原始模板鏈加上所有新產(chǎn)生的鏈成為下一輪延伸的模板鏈，導(dǎo)致特定DNA目標(biāo)區(qū)域的指數(shù)(幾何)擴(kuò)增。南京骨頭PCR檢測(cè)技術(shù)網(wǎng)站逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)較廣用于表達(dá)譜，以確定基因的表達(dá)或鑒定RNA轉(zhuǎn)錄物的序列。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的常見問題：陰性：需注意的是有時(shí)忘加Taq酶或溴乙錠。引物：引物質(zhì)量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對(duì)稱，是PCR失敗或擴(kuò)增條帶不理想、容易彌散的常見原因。有些批號(hào)的引物合成質(zhì)量有問題，兩條引物一條濃度高，一條濃度低，造成低效率的不對(duì)稱擴(kuò)增，對(duì)策為：選定一個(gè)好的引物合成單位。引物的濃度不但要看OD值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現(xiàn)，而且兩引物帶的亮度應(yīng)大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無(wú)條帶，此時(shí)做PCR有可能失敗，應(yīng)和引物合成單位協(xié)商解決。如一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時(shí)要平衡其濃度。引物應(yīng)高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長(zhǎng)期放冰箱冷藏部分，導(dǎo)致引物變質(zhì)降解失效。引物設(shè)計(jì)不合理，如引物長(zhǎng)度不夠，引物之間形成二聚體等。

聚合酶鏈反應(yīng)：多重連接依賴探針擴(kuò)增（MLPA):允許用單個(gè)引物對(duì)擴(kuò)增多個(gè)靶標(biāo)，從而避免多重PCR的分辨率限制。多重聚合酶鏈反應(yīng):由單個(gè)PCR混合物中的多個(gè)引物組組成，以產(chǎn)生對(duì)不同DNA序列特異的不同大小的擴(kuò)增子。通過同時(shí)靶向多個(gè)基因，可以從單次測(cè)試中獲得額外的信息，否則將需要幾次試劑和更多時(shí)間來執(zhí)行。每個(gè)引物組的退火溫度必須優(yōu)化，以在單個(gè)反應(yīng)中正確工作，并符合擴(kuò)增子尺寸。也就是說，當(dāng)通過凝膠電泳可視化時(shí)，它們的堿基對(duì)長(zhǎng)度應(yīng)該足夠不同以形成不同的條帶。聚合酶鏈反應(yīng)是一種非常強(qiáng)大和實(shí)用的研究工具。

聚合酶鏈反應(yīng)：在檢測(cè)病原體方面,病原體培養(yǎng)是臨床診斷的金標(biāo)準(zhǔn) .但是對(duì)于一些苛養(yǎng)菌 生長(zhǎng)緩慢的細(xì)菌或難以培養(yǎng)的病原體等培養(yǎng)的陽(yáng)性檢出率不高.檢測(cè)時(shí)間過長(zhǎng) 無(wú)法滿足臨床早期快速診斷以指導(dǎo)醫(yī)治的需要[3]。當(dāng)前 PCR 技術(shù)是在傳統(tǒng) PCR 技術(shù)應(yīng)用的基礎(chǔ)上進(jìn)行的改進(jìn)，包括實(shí)時(shí)定量 PCR 技術(shù) 、 實(shí)時(shí)熒光定量PCR、 PCR-酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) 、 巢式PCR等。 在PCR技術(shù)的輔助作用下，實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)也逐漸從生化免疫診斷過渡到基因診斷，生化免疫檢測(cè)主要從表型表現(xiàn)評(píng)估病癥，而基因診斷則深入本質(zhì)探究其病因，以PCR 技術(shù)為主的核酸技術(shù)在臨床實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)與疾病診斷中表現(xiàn)出了明顯的應(yīng)用價(jià)值，在未來的臨床醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中必將會(huì)得到更加較廣的應(yīng)用。PCR產(chǎn)物的生成量是以指數(shù)方式增加的，能將皮克量級(jí)的起始待測(cè)模板擴(kuò)增到微克水平。南京骨頭PCR檢測(cè)技術(shù)網(wǎng)站

聚合酶鏈反應(yīng)的一個(gè)主要限制是，為了產(chǎn)生允許其選擇性擴(kuò)增的引物，需要關(guān)于目標(biāo)序列的先前信息。南京骨頭PCR檢測(cè)技術(shù)網(wǎng)站

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的常見問題：靶序列變異：如靶序列發(fā)生突變或缺失，影響引物與模板特異性結(jié)合，或因靶序列某 段缺失使引物與模板失去互補(bǔ)序列，其PCR擴(kuò)增是不會(huì)成功的。假陽(yáng)性：出現(xiàn)的PCR擴(kuò)增條帶與目的靶序列條帶一致，有時(shí)其條帶更整齊，亮度更高。引物設(shè)計(jì)不合適：選擇的擴(kuò)增序列與非目的擴(kuò)增序列有同源性，因而在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現(xiàn)假陽(yáng)性。需重新設(shè)計(jì)引物。出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶：PCR擴(kuò)增有時(shí)出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過多或酶的質(zhì)量差，dNTP濃度過高，Mg2+濃度過高，退火溫度過低，循環(huán)次數(shù)過多引起。其對(duì)策有：減少酶量，或調(diào)換另一來源的酶。②減少dNTP的濃度。適當(dāng)降低Mg2+濃 度。增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。南京骨頭PCR檢測(cè)技術(shù)網(wǎng)站

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