無(wú)錫分子生物學(xué)熒光PCR

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)：模板的制備，PCR的模板可以是DNA，也可以是RNA。模板的取材主要依據(jù)PCR的擴(kuò)增對(duì)象，可以是病原體標(biāo)本如病毒、細(xì)菌、菌類等。也可以是病理生理標(biāo)本如細(xì)胞、血液、羊水細(xì)胞等。法醫(yī)學(xué)標(biāo)本有血斑、精斑、毛發(fā)等。標(biāo)本處理的基本要求是除去雜質(zhì)，并部分純化標(biāo)本中的核酸。多數(shù)樣品需要經(jīng)過(guò)SDS和蛋白酶K處理。難以破碎的細(xì)菌，可用溶菌酶加EDTA處理。所得到的粗制DNA，經(jīng)酚、氯仿抽提純化，再用乙醇沉淀后用作PCR反應(yīng)模板。PCR反應(yīng)的特異性決定因素為：引物與模板DNA特異正確的結(jié)合。無(wú)錫分子生物學(xué)熒光PCR

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的試驗(yàn)污染：陽(yáng)性對(duì)照：在建立PCR反應(yīng)實(shí)驗(yàn)室及一般的檢驗(yàn)單位都應(yīng)設(shè)有PCR陽(yáng)性對(duì)照，它是PCR反應(yīng)是否成功、產(chǎn)物條帶位置及大小是否合乎理論要求的一個(gè)重要的參考標(biāo)志。陽(yáng)性對(duì)照要選擇擴(kuò)增度中等、重復(fù)性好，經(jīng)各種鑒定是該產(chǎn)物的標(biāo)本，如以重組質(zhì)粒為陽(yáng)性對(duì)照，其含量宜低不宜高（100個(gè)拷貝以下）。但陽(yáng)性對(duì)照尤其是重組質(zhì)粒及高濃度陽(yáng)性標(biāo)本，其對(duì)檢測(cè)或擴(kuò)增樣品污染的可能性很大。因而當(dāng)某一PCR試劑經(jīng)自己使用穩(wěn)定，檢驗(yàn)人員心中有數(shù)時(shí)，在以后的實(shí)驗(yàn)中可免設(shè)陽(yáng)性對(duì)照。陰性對(duì)照：每次PCR實(shí)驗(yàn)務(wù)必做陰性對(duì)照。它包括：標(biāo)本對(duì)照：被檢的標(biāo)本是血清就用鑒定后的正常血清作對(duì)照；被檢的標(biāo)本是組織細(xì)胞就用相應(yīng)的組織細(xì)胞作對(duì)照。試劑對(duì)照：在PCR試劑中不加模板DNA或RNA,進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以監(jiān)測(cè)試劑是否污染。無(wú)錫組織熒光PCR聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)：模板的制備，PCR的模板可以是DNA，也可以是RNA。

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聚合酶鏈反應(yīng)注意事項(xiàng)：在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中要防止RNA的降解，保持RNA的完整性。在總RNA的提取過(guò)程中，注意避免mRNA的斷裂；為了防止非特異性擴(kuò)增，必須設(shè)陰性對(duì)照；內(nèi)參的設(shè)定：主要為了用于靶RNA的定量。常用的內(nèi)參有G3PD（甘油醛-3-磷酸脫氫酶）、β-Actin（β-肌動(dòng)蛋白）等。其目的在于避免RNA定量誤差、加樣誤差以及各PCR反應(yīng)體系中擴(kuò)增效率不均一各孔間的溫度差等所造成的誤差；PCR不能進(jìn)入平臺(tái)期，出現(xiàn)平臺(tái)效應(yīng)與所擴(kuò)增的目的基因的長(zhǎng)度、序列、二級(jí)結(jié)構(gòu)以及目標(biāo)DNA起始的數(shù)量有關(guān)。故對(duì)于每一個(gè)目標(biāo)序列出現(xiàn)平臺(tái)效應(yīng)的循環(huán)數(shù)，均應(yīng)通過(guò)單獨(dú)實(shí)驗(yàn)來(lái)確定；防止DNA的污染： 采用DNA酶處理RNA； 在可能的情況下，將PCR引物置于基因的不同外顯子，以消除基因和mRNA的共線性。重疊延伸聚合酶鏈反應(yīng)可以將缺失、插入或點(diǎn)突變引入DNA序列。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)準(zhǔn)備：引物內(nèi)部不應(yīng)出現(xiàn)互補(bǔ)序列。兩個(gè)引物之間不應(yīng)存在互補(bǔ)序列，尤其是避免3 ′端的互補(bǔ)重疊。引物與非特異擴(kuò)增區(qū)的序列的同源性不要超過(guò)70%，引物3′末端連續(xù)8個(gè)堿基在待擴(kuò)增區(qū)以外不能有完全互補(bǔ)序列，否則易導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增。引物3‘端的堿基，特別是很末及倒數(shù)第二個(gè)堿基，應(yīng)嚴(yán)格要求配對(duì)，很好選擇是G和C。引物的5′端可以修飾。如附加限制酶位點(diǎn)，引入突變位點(diǎn)，用生物素、熒光物質(zhì)、地高辛標(biāo)記，加入其它短序列，包括起始密碼子、終止密碼子等。聚合酶鏈反應(yīng)五要素：參加PCR反應(yīng)的物質(zhì)主要有五種即：引物、酶、dNTP、模板和緩沖液。無(wú)錫組織熒光PCR

像所有酶一樣，DNA聚合酶也容易出錯(cuò)，這反過(guò)來(lái)會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)生的PCR片段發(fā)生突變。無(wú)錫分子生物學(xué)熒光PCR

PCR的反應(yīng)條件：Tm=4（G+c）+（A+T），一般在45～55度，溫度低容易退火但特異性低；溫度高，不容易退火但特異性高。退火時(shí)間30秒。延伸溫度一般在70～75度這時(shí)TaqDNA聚合酶活性很高（150個(gè)/S），當(dāng)引物在16個(gè)堿基以下時(shí)可采用緩慢升高溫度到70～75度的方法，使在低溫下就開(kāi)始合成。一般<1KB時(shí)間1分鐘即可。當(dāng)〈1KB時(shí)在較后的循環(huán)中延長(zhǎng)擴(kuò)增時(shí)間。循環(huán)次數(shù)25～30次。無(wú)產(chǎn)物時(shí)：取10ul擴(kuò)增混合液作模板在進(jìn)行PCR擴(kuò)增；增加TaqDNA聚合酶濃度；增加循環(huán)次數(shù)；降低退火溫度；加靶DNA量。無(wú)錫分子生物學(xué)熒光PCR