徐州特殊樣本數(shù)字PCR

聚合酶鏈式反應的試驗污染：陽性對照：在建立PCR反應實驗室及一般的檢驗單位都應設有PCR陽性對照，它是PCR反應是否成功、產物條帶位置及大小是否合乎理論要求的一個重要的參考標志。陽性對照要選擇擴增度中等、重復性好，經各種鑒定是該產物的標本，如以重組質粒為陽性對照，其含量宜低不宜高（100個拷貝以下）。但陽性對照尤其是重組質粒及高濃度陽性標本，其對檢測或擴增樣品污染的可能性很大。因而當某一PCR試劑經自己使用穩(wěn)定，檢驗人員心中有數(shù)時，在以后的實驗中可免設陽性對照。陰性對照：每次PCR實驗務必做陰性對照。它包括：標本對照：被檢的標本是血清就用鑒定后的正常血清作對照；被檢的標本是組織細胞就用相應的組織細胞作對照。試劑對照：在PCR試劑中不加模板DNA或RNA,進行PCR擴增，以監(jiān)測試劑是否污染。為了很大限度地減少污染的可能性，調查人員應該為試劑制備、聚合酶鏈反應和產品分析預留單獨的房間。徐州特殊樣本數(shù)字PCR

聚合酶鏈式反應的特點：特異性強，PCR反應的特異性決定因素為：引物與模板DNA特異正確的結合；堿基配對原則；Taq DNA聚合酶合成反應的忠實性；靶基因的特異性與保守性。其中引物與模板的正確結合是關鍵。引物與模板的結合及引物鏈的延伸是遵循堿基配對原則的。聚合酶合成反應的忠實性及TaqDNA聚合酶耐高溫性，使反應中模板與引物的結合（復性）可以在較高的溫度下進行，結合的特異性增加，被擴增的靶基因片段也就能保持很高的正確度。再通過選擇特異性和保守性高的靶基因區(qū)，其特異性程度就更高。珠海骨頭熒光PCR技術服務聚合酶鏈式反應準備：PCR所用的酶主要有兩種來源：Taq和Pfu，分別來自兩種不同的噬熱菌。

聚合酶鏈式反應準備：引物內部不應出現(xiàn)互補序列。兩個引物之間不應存在互補序列，尤其是避免3 ′端的互補重疊。引物與非特異擴增區(qū)的序列的同源性不要超過70%，引物3′末端連續(xù)8個堿基在待擴增區(qū)以外不能有完全互補序列，否則易導致非特異性擴增。引物3‘端的堿基，特別是很末及倒數(shù)第二個堿基，應嚴格要求配對，很好選擇是G和C。引物的5′端可以修飾。如附加限制酶位點，引入突變位點，用生物素、熒光物質、地高辛標記，加入其它短序列，包括起始密碼子、終止密碼子等。

聚合酶鏈反應的常見問題分析與解決方法：MgCl2濃度過高?？蛇m當降低其用量。模板量過多。質粒DNA的用量應<50 ng，而基因組DNA則應<200 ng。引物濃度不夠優(yōu)化。對引物進行梯度稀釋重復PCR反應。循環(huán)次數(shù)過多；增加模板量減少循環(huán)次數(shù)至30，縮短退火時間及延伸時間，或改用二種溫度的PCR循環(huán)。退火溫度過低。電泳體系有問題：凝膠中緩沖液和電泳緩沖液濃度相差太大；凝膠沒有凝固好；瓊脂糖質量差。若為PCR試劑盒則可能：由于運輸儲存不當引起試劑盒失效；試劑盒本身質量有問題，如引物選擇、循環(huán)參數(shù)等選擇不當。降解的陳舊模板擴增也易產生涂布。逆轉錄酶將核糖核酸逆轉錄成cDNA ，然后通過聚合酶鏈反應進行擴增。

聚合酶鏈反應的常見問題分析與解決方法：擴增產物出現(xiàn)多條帶(雜帶)：引物用量偏大，引物的特異性不高。應調換引物或降低引物的使用量。循環(huán)的次數(shù)過多。適當增加模板的量，減少循環(huán)次數(shù)。酶的用量偏高或酶的質量不好，應降低酶量或調換另一來源的酶。退火溫度偏低，退火及延伸時間偏長。應提高退火溫度，減少變性與延伸時間，也可采用二種溫度的PCR擴增。以2度為梯度設計梯度PCR反應優(yōu)化退火溫度。 樣品處理不當。Mg2+濃度偏高，因適當調整Mg2+使用濃度。若為PCR試劑盒，也可能時試劑盒本身質量有問題。復制提前終止。使用非熱啟動的聚合酶時常有發(fā)生。冰上準備反應體系或采用熱啟動聚合酶。PCR的另一個限制是，即使是很少量的污染DNA也可以被擴增，導致誤導或模糊的結果。南通實時RT-PCR檢測技術技術服務

熱啟動聚合酶鏈式反應：一種在PCR的初始建立階段減少非特異性擴增的技術。徐州特殊樣本數(shù)字PCR

聚合酶鏈式反應的常見問題：靶序列或擴增產物的交叉污染：這種污染有兩種原因：一是整個基因組或大片段的交叉污染，導致假陽性。這種假陽性可用以下方法解決：操作時應小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣內或濺出離心管外。除酶及不能耐高溫的物質外，所有試劑或器材均應高壓消毒。所用離心管及樣進頭等均應一次性使用。必要時，在加標本前，反應管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性?？苫ハ嗥唇?，與引物互補后，可擴增出PCR產物，而導致假陽性的產生，可用巢式PCR方法來減輕或消除。徐州特殊樣本數(shù)字PCR