廣州雙螺旋科學(xué)儀器供應(yīng)銷售廣州市全自動數(shù)字PCR分析應(yīng)用批發(fā)

  大多數(shù)定量分析本質(zhì)上是模擬的，得到的是從總樣本量中測量的平均信號。當(dāng)前測量特定DNA量的金標(biāo)準(zhǔn)是定量PCR (qPCR)。qPCR使用特定的互補(bǔ)寡核苷酸引物，結(jié)合熒光讀數(shù)放大感興趣的目標(biāo)，其熒光信號基于DNA嵌入染料或水解探針(水解探針為高度嚴(yán)格的測定提供額外的特異性)。

  然而，qPCR有許多技術(shù)限制，包括需要使用與被評估樣品質(zhì)量相似的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行測定校準(zhǔn)。為了獲得 合格的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較，可能導(dǎo)致反復(fù)的工作流程和挑戰(zhàn)。由于檢測之間的潛在競爭，多重檢測可能并不容易實(shí)現(xiàn)。此外，兩個樣品之間定量的理論極限是2倍(對應(yīng)于單個PCR循環(huán)閾值)，這對于異質(zhì)材料的拷貝數(shù)變異應(yīng)用通常是不夠的。通常檢測野生型gDNA中突變gDNA(次要等位基因頻率或MAF)的典型檢測靈敏度范圍為1-10%，一些高度開發(fā)的qPCR檢測能達(dá)到約0.1%MAF的檢測限。

  數(shù)字PCR (Digital PCR，dPCR)是一種精確定量核酸的新方法。它使用與標(biāo)準(zhǔn)模擬測量中使用的相似的測定試劑，但以數(shù)字格式計算單個目標(biāo)分子的總數(shù)，從而實(shí)現(xiàn)了許多需要高靈敏度且樣品可用性受限的應(yīng)用。如今小編就帶大家來詳細(xì)了解一下數(shù)字PCR。

  數(shù)字PCR的工作原理

  數(shù)字PCR測量是通過將樣品和qPCR測定混合物，分成大量單獨(dú)的小體積反應(yīng)來進(jìn)行的，這樣在任何單個反應(yīng)中都存在零個或一個目標(biāo)分子(圖1)。這是進(jìn)行“數(shù)字”測量的基本概念。熱循環(huán)進(jìn)行到終點(diǎn)時，任何包含目標(biāo)的微反應(yīng)單元(微反應(yīng)器或微滴)都會發(fā)出明亮的熒光，而沒有目標(biāo)的微反應(yīng)單元將只有背景熒光。沒有目標(biāo)分子的反應(yīng)計為0(PCR陰性)，有一個目標(biāo)分子的反應(yīng)計為1(PCR陽性)。當(dāng)計算整組的反應(yīng)時，“陽性”反應(yīng)的總數(shù)等于整個體積中原始靶分子的數(shù)量，反應(yīng)總數(shù)乘以單個反應(yīng)體積等于檢測的總體積。因此，目標(biāo)的***濃度很容易計算為等于目標(biāo)分子的總數(shù)除以總測量體積。這種“***”測量的不確定性，*來自測量體積的誤差或微反應(yīng)單元中存在多個目標(biāo)分子，因此控制這兩個因素的數(shù)字PCR方法可提供比較高的準(zhǔn)確度。

  圖1.分離和數(shù)字計數(shù)提供靈敏的***定量。數(shù)字PCR是通過將樣品和檢測試劑(例如qPCR水解探針和引物)分成足夠多的**微反應(yīng)單元來進(jìn)行的，這樣任何反應(yīng)都將*包含0個或1個目標(biāo)分子。進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)終點(diǎn)PCR并計算熒光反應(yīng)的數(shù)量。PCR陽性“亮”反應(yīng)各包含1個靶分子，PCR陰性“暗”反應(yīng)沒有靶分子

  當(dāng)目標(biāo)分子被分成不同的微反應(yīng)單元時，可以根據(jù)泊松分布原理計算多個目標(biāo)分子在同一微反應(yīng)單元***同定位的機(jī)會。當(dāng)目標(biāo)分子的數(shù)量***小于微反應(yīng)單元的數(shù)量(低占用率)時，多個目標(biāo)分子共用一個微反應(yīng)單元的機(jī)會很小。泊松分布可以用作一個小的校正因子(低占用率時)，也可用于計算估計濃度(高占用率時)。通過直接計數(shù)單個分子(低占用率)，將樣品分成大量微反應(yīng)單元的數(shù)字PCR平臺將具有比較高的準(zhǔn)確度。同樣，使用更多微反應(yīng)單元進(jìn)行的數(shù)字PCR提供了比較高的靈敏度——檢測限接近百萬分之一，輸入的動態(tài)范圍**廣——超過6個對數(shù)。

  如何使用數(shù)字PCR進(jìn)行多重qPCR測定

  當(dāng)在數(shù)字范圍內(nèi)(所有微反應(yīng)單元包含0或1個目標(biāo)分子)時，可以在不考慮競爭或交叉反應(yīng)的情況下進(jìn)行多重qPCR測定，因?yàn)槊總€包含目標(biāo)的反應(yīng)都會隨著目標(biāo)與其引物/探針特異性結(jié)合而進(jìn)行，而在沒有目標(biāo)的微反應(yīng)單元中不會發(fā)生反應(yīng)。

  將每個分子放在一個單獨(dú)的微反應(yīng)單元中，使得在同一實(shí)驗(yàn)中同時計算高豐度和低豐度目標(biāo)，而無需擔(dān)心“淹沒”低豐度目標(biāo)(因?yàn)槊總€室**多有1個目標(biāo)，與其平均濃度無關(guān)樣品量)。當(dāng)對多個目標(biāo)進(jìn)行計數(shù)時(例如，二重測定形式)，一個目標(biāo)相對于另一個目標(biāo)的計數(shù)比率(例如，突變等位基因與野生型等位基因)使“***比率”能夠被量化，使用其之一目標(biāo)作為內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)化參考(例如，加載了多少可擴(kuò)增的基因組等價物)，而該目標(biāo)已經(jīng)經(jīng)歷了與其他目標(biāo)測定相同的實(shí)驗(yàn)。

  此外，由于數(shù)字PCR是作為終點(diǎn)反應(yīng)進(jìn)行的(PCR在測量熒光之前運(yùn)行至完成)，因此將真正的單個靶分子分離出來可以根據(jù)探針強(qiáng)度進(jìn)行多重分析。通過以限制濃度添加目標(biāo)特異性熒光檢測試劑，具有該目標(biāo)分子的微反應(yīng)單元將是PCR陽性的，但在PCR終點(diǎn)處亮度有限。為了計算第二種目標(biāo)類型，以更高濃度添加具有相同“顏色”的不同目標(biāo)特異性探針。具有第二個目標(biāo)分子的微反應(yīng)單元在PCR終點(diǎn)處將具有比具有***個目標(biāo)的微反應(yīng)單元更亮的信號，從而可以對每個目標(biāo)進(jìn)行單獨(dú)計數(shù)。不同顏色探針和不同濃度探針的組合可用于更高水平的多重檢測(圖2)。

  圖2. 數(shù)字PCR支持更高復(fù)雜度檢測的策略。多個目標(biāo)類型可以在同一個樣本中通過同時使用不同的“顏色”(例如，含有不同染料的水解探針)和不同的“強(qiáng)度”(例如，通過使用不同的探針濃度，可以在PCR終點(diǎn)區(qū)分具有不同靶標(biāo)特異性但相同染料的探針)。任何單個反應(yīng)都包含所有檢測和0或1個目標(biāo)，排除競爭。通過以特定比例混合具有相同序列但不同染料的探針(例如，目標(biāo)4和5)，可以提供更多的多重檢測能力