用qPCR法進(jìn)行rcAAV復(fù)制型腺相關(guān)病毒檢測(cè)時(shí)，出現(xiàn)擴(kuò)增效率超出標(biāo)準(zhǔn)要求（低于83.3%或高于110%）的原因有哪些？①設(shè)計(jì)的引物探針不適用：重新分析靶標(biāo)序列進(jìn)行設(shè)計(jì)。②標(biāo)曲濃度設(shè)定太高，超出標(biāo)曲線性范圍：對(duì)范圍進(jìn)行驗(yàn)證，選取合適標(biāo)曲范圍。③人員操作問題，如稀釋錯(cuò)誤、制備過程震蕩時(shí)間過長(zhǎng)等：人員上崗前應(yīng)接受多面培訓(xùn)并做到熟練操作，考核合格后方可上崗。④移液器未校準(zhǔn)或品質(zhì)問題導(dǎo)致量取不準(zhǔn)：定期對(duì)移液器進(jìn)行校準(zhǔn)并選擇好品質(zhì)移液器。重組腺相關(guān)病毒檢測(cè)要求有哪些？南京復(fù)制型慢病毒檢測(cè)原理
《CAR-T細(xì)胞治 療產(chǎn)品質(zhì)量控制檢測(cè)研究及非臨床研究考慮要點(diǎn)》一文提到：目前RCR/RCL病毒檢測(cè)方法主要有指示細(xì)胞培養(yǎng)法、ELISA法(p24蛋白測(cè)定)、PCR/q-PCR法（通過psi-gag或VSV-G聚合酶鏈反應(yīng)）和轉(zhuǎn)錄酶活性測(cè)定法(PERT)等。其中，利用指示細(xì)胞培養(yǎng)法對(duì)生產(chǎn)過程中的病毒（上清液、病毒生產(chǎn)終末期細(xì)胞）存在的RCL進(jìn)行培養(yǎng)擴(kuò)增，并在培養(yǎng)終點(diǎn)進(jìn)行重復(fù)檢測(cè)是FDA推薦的RCL檢測(cè)方法。
《CAR-T細(xì)胞治 療產(chǎn)品質(zhì)量控制檢測(cè)研究及非臨床研究考慮要點(diǎn)》一文提到：目前RCR/RCL病毒檢測(cè)方法主要有指示細(xì)胞培養(yǎng)法、ELISA法(p24蛋白測(cè)定)、PCR/q-PCR法（通過psi-gag或VSV-G聚合酶鏈反應(yīng)）和轉(zhuǎn)錄酶活性測(cè)定法(PERT)等。其中，利用指示細(xì)胞培養(yǎng)法對(duì)生產(chǎn)過程中的病毒（上清液、病毒生產(chǎn)終末期細(xì)胞）存在的RCL進(jìn)行培養(yǎng)擴(kuò)增，并在培養(yǎng)終點(diǎn)進(jìn)行重復(fù)檢測(cè)是FDA推薦的RCL檢測(cè)方法。 杭州正揚(yáng)生物復(fù)制型逆轉(zhuǎn)錄病毒檢測(cè)注意事項(xiàng)南京正揚(yáng)有復(fù)制型病毒檢測(cè)試劑盒試劑盒性能如何？
qPCR法RCL/RCR病毒檢測(cè)：目前許多CAR-T企業(yè)采用Q-PCR方法直接測(cè)定CAR-T終產(chǎn)品中的VSV-G序列或psi-gag序列，因考慮到CAR-T細(xì)胞種產(chǎn)品一般需要新鮮輸注的特殊情況，基于細(xì)胞培養(yǎng)法的RCL/RCR檢測(cè)方法周期較長(zhǎng)，建議在細(xì)胞產(chǎn)品制備過程中進(jìn)行多面控制(如對(duì)慢病毒載體及生產(chǎn)終末細(xì)胞采用基于細(xì)胞培養(yǎng)方法測(cè)定RCL/RCR，以確保生產(chǎn)工藝過程中不存在RCL的風(fēng)險(xiǎn))，細(xì)胞終產(chǎn)品階段可采用qPCR檢測(cè)法快速放行。qPCR法RCL/RCR病毒檢測(cè)：目前許多CAR-T企業(yè)采用Q-PCR方法直接測(cè)定CAR-T終產(chǎn)品中的VSV-G序列或psi-gag序列，因考慮到CAR-T細(xì)胞種產(chǎn)品一般需要新鮮輸注的特殊情況，基于細(xì)胞培養(yǎng)法的RCL/RCR檢測(cè)方法周期較長(zhǎng)，建議在細(xì)胞產(chǎn)品制備過程中進(jìn)行多面控制(如對(duì)慢病毒載體及生產(chǎn)終末細(xì)胞采用基于細(xì)胞培養(yǎng)方法測(cè)定RCL/RCR，以確保生產(chǎn)工藝過程中不存在RCL的風(fēng)險(xiǎn))，細(xì)胞終產(chǎn)品階段可采用qPCR檢測(cè)法快速放行。。
基于細(xì)胞培養(yǎng)法和qPCR快檢法都能實(shí)現(xiàn)對(duì)重組腺相關(guān)病毒載體(rAAV)中復(fù)制型腺相關(guān)病毒(rcAAV)的污染率的檢測(cè)，但兩者在實(shí)際檢測(cè)中都存在檢測(cè)值不夠準(zhǔn)確的風(fēng)險(xiǎn)（基于細(xì)胞培養(yǎng)法存在低于實(shí)際值的風(fēng)險(xiǎn)qPCR快檢法存在高于實(shí)際值的風(fēng)險(xiǎn)）。南京正揚(yáng)生物科技有限公司自主研發(fā)生產(chǎn)的復(fù)制性腺相關(guān)病毒檢測(cè)試劑盒（PCR熒光探針法）是一款既適用于基于細(xì)胞培養(yǎng)法對(duì)rcAAV的檢測(cè)，也適用于對(duì)rcAAV的直接檢測(cè)的試劑盒，可達(dá)到兩種方法間相互驗(yàn)證、相互補(bǔ)充的目的。試劑盒中Reference基因和Target基因包含在同一定量參考品中可同時(shí)實(shí)現(xiàn)對(duì)rAAV載體和rcAAV濃度快速、靈敏、特異性的定量檢測(cè)。CAR-T細(xì)胞醫(yī)治產(chǎn)品中復(fù)制型慢病毒檢測(cè)的監(jiān)管要求。
慢病毒載體是以人類免疫缺陷Ⅰ型病毒（humanimmunodeficiencyvirus，HIV-1）為基礎(chǔ)發(fā)展起來的基因醫(yī)治載體，屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒家族，又區(qū)別于一般的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，比逆轉(zhuǎn)錄病毒載體具有更強(qiáng)的感 染能力，具有容納外源性目的基因片段大、穩(wěn)定整合、持久表達(dá)、免疫反應(yīng)小等優(yōu)點(diǎn)，是常用的基因轉(zhuǎn)移載體。而載體作為基因醫(yī)治的工具，可能帶來插入突變、復(fù)制型病毒、外源因子污染等風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)其攜帶的遺傳物質(zhì)是CAR-T細(xì)胞的重要組成部分，是使T細(xì)胞具有強(qiáng)大的識(shí)別和殺傷腫瘤細(xì)胞活性的重要基礎(chǔ)，考慮到病毒載體技術(shù)的廣泛應(yīng)用，具有復(fù)制能力的慢病毒/逆轉(zhuǎn)錄病毒檢測(cè)成為重要問題，F(xiàn)DA及歐盟先后出臺(tái)相關(guān)文件，要求建立靈敏、可靠的復(fù)制能力的慢病毒/逆轉(zhuǎn)錄病毒檢測(cè)方法。復(fù)制型慢病毒檢測(cè)方法有哪些？深圳正揚(yáng)生物RCR病毒檢測(cè)服務(wù)
復(fù)制型逆轉(zhuǎn)錄病毒檢測(cè)方法有哪些？南京復(fù)制型慢病毒檢測(cè)原理
病毒作為基因載體已普遍用于基因和細(xì)胞醫(yī)治產(chǎn)品。目前常見的病毒載體包括慢病毒（Lentiviral）、逆轉(zhuǎn)錄病毒（Retrovirus）、腺病毒（Adenovirus）、腺相關(guān)病毒（AAV）等。在生產(chǎn)過程中，如果被有復(fù)制能力的病毒污染，或載體發(fā)生重組，病毒載體中可能會(huì)混雜有復(fù)制型病毒。復(fù)制型慢病毒/逆轉(zhuǎn)錄病毒（RCL/RCR）可將病毒基因組整合到細(xì)胞基因組中，存在激 活原ai基因、破壞抑ai基因造成二次中瘤的風(fēng)險(xiǎn)；同時(shí)因其具有復(fù)制性，且用水泡性口炎病毒糖蛋白（VSV-G）替代了env編碼的包膜糖蛋白，提高了病毒的嗜性范圍，增加RCR/RCL帶來的潛在風(fēng)險(xiǎn)；而如果出現(xiàn)復(fù)制型腺相關(guān)病毒（rcAAV），其則會(huì)在被感 染的細(xì)胞中表達(dá)cap或rep基因，容易導(dǎo)致意外的免疫反應(yīng)。因此，各國(guó)法規(guī)對(duì)復(fù)制性 病毒檢測(cè)都提出了明確要求。南京復(fù)制型慢病毒檢測(cè)原理