基因治 療產(chǎn)品是近年來國內(nèi)外藥物研發(fā)的熱點，通常由各種病毒或非病毒載體攜帶治 療基因組成。在病毒載體中，慢病毒載體(LVs)由于其有效的將基因整合進靶細胞基因組、穩(wěn)定的基因表達等特點，被認為是蕞有希望的基因治 療載體?？紤]到慢病毒對人的病原性及相關(guān)的安全性，所使用的慢病毒載體均為復(fù)制缺陷型載體，但在病毒載體生產(chǎn)過程中可能由于同源重組或非同源重組導(dǎo)致可復(fù)制性慢病毒(RCL)的產(chǎn)生，RCL可以整合到細胞基因組中，從而導(dǎo)致原ai基因激 活，抑ai基因破壞等，因此，這類產(chǎn)品中的復(fù)制型慢病毒檢測是安全性檢測中非常重要的項目，美國FDA及中國CDE都要求在生產(chǎn)的整個過程及不同階段都要進行RCL檢測，以確保無RCL的污染。復(fù)制型病毒檢測試劑盒要求有哪些？正揚生物rcAAV病毒檢測廠家
qPCR法RCL/RCR病毒檢測：目前許多CAR-T企業(yè)采用Q-PCR方法直接測定CAR-T終產(chǎn)品中的VSV-G序列或psi-gag序列，因考慮到CAR-T細胞種產(chǎn)品一般需要新鮮輸注的特殊情況，基于細胞培養(yǎng)法的RCL/RCR檢測方法周期較長，建議在細胞產(chǎn)品制備過程中進行多面控制(如對慢病毒載體及生產(chǎn)終末細胞采用基于細胞培養(yǎng)方法測定RCL/RCR，以確保生產(chǎn)工藝過程中不存在RCL的風(fēng)險)，細胞終產(chǎn)品階段可采用qPCR檢測法快速放行。qPCR法RCL/RCR病毒檢測：目前許多CAR-T企業(yè)采用Q-PCR方法直接測定CAR-T終產(chǎn)品中的VSV-G序列或psi-gag序列，因考慮到CAR-T細胞種產(chǎn)品一般需要新鮮輸注的特殊情況，基于細胞培養(yǎng)法的RCL/RCR檢測方法周期較長，建議在細胞產(chǎn)品制備過程中進行多面控制(如對慢病毒載體及生產(chǎn)終末細胞采用基于細胞培養(yǎng)方法測定RCL/RCR，以確保生產(chǎn)工藝過程中不存在RCL的風(fēng)險)，細胞終產(chǎn)品階段可采用qPCR檢測法快速放行。。杭州正揚生物RCR病毒檢測操作流程復(fù)制型腺相關(guān)病毒檢測。
基于細胞培養(yǎng)法和qPCR快檢法都能實現(xiàn)對重組腺相關(guān)病毒載體(rAAV)中復(fù)制型腺相關(guān)病毒(rcAAV)的污染率的檢測，但兩者在實際檢測中都存在檢測值不夠準確的風(fēng)險（基于細胞培養(yǎng)法存在低于實際值的風(fēng)險qPCR快檢法存在高于實際值的風(fēng)險）。南京正揚生物科技有限公司自主研發(fā)生產(chǎn)的復(fù)制性腺相關(guān)病毒檢測試劑盒（PCR熒光探針法）是一款既適用于基于細胞培養(yǎng)法對rcAAV的檢測，也適用于對rcAAV的直接檢測的試劑盒，可達到兩種方法間相互驗證、相互補充的目的。試劑盒中Reference基因和Target基因包含在同一定量參考品中可同時實現(xiàn)對rAAV載體和rcAAV濃度快速、靈敏、特異性的定量檢測。
實時熒光定量PCR法rcAAV復(fù)制型腺相關(guān)病毒檢測試劑盒的操作流程包括病毒DNA提取、qPCR試劑配制、qPCR加樣及上機檢測、結(jié)果分析四個環(huán)節(jié)。病毒DNA提取包含樣品前處理、樣品裂解液消化、病毒DNA與磁珠結(jié)合、一次洗滌、二次洗滌、洗脫；qPCR試劑在配制時需先將試劑放置于室溫，避光放置30min，直至試劑融化，各個試劑組分混勻后按照說明書進行配制并分裝。在實驗室，注意分區(qū)操作，降低實驗發(fā)生污染的風(fēng)險。
實時熒光定量PCR法rcAAV復(fù)制型腺相關(guān)病毒檢測試劑盒的操作流程包括病毒DNA提取、qPCR試劑配制、qPCR加樣及上機檢測、結(jié)果分析四個環(huán)節(jié)。病毒DNA提取包含樣品前處理、樣品裂解液消化、病毒DNA與磁珠結(jié)合、一次洗滌、二次洗滌、洗脫；qPCR試劑在配制時需先將試劑放置于室溫，避光放置30min，直至試劑融化，各個試劑組分混勻后按照說明書進行配制并分裝。在實驗室，注意分區(qū)操作，降低實驗發(fā)生污染的風(fēng)險。 為什么要做復(fù)制型病毒檢測？
根據(jù)現(xiàn)有法規(guī)和指導(dǎo)原則可以發(fā)現(xiàn)，RCL病毒檢測方法主要包含指示細胞培養(yǎng)法、ELISA法、PCR/q-PCR法和PERT法。因為指示細胞培養(yǎng)法檢測需28天，并且因為陽性對照病毒的性質(zhì)，要求其需要在P3或者P2實驗室環(huán)境中進行，致使該方法具有耗時長，環(huán)境要求高的特點。相比而言,基于VSV-G序列的q-PCR方法或基于psi-gag序列的PCR方法，因其具有檢測時間短、環(huán)境條件簡單、靈敏度高和可重復(fù)性強等優(yōu)點，被許多CAR-T申報企業(yè)作為快速放行方法。歡迎聯(lián)系復(fù)制型慢病毒檢測方法有哪些？寧波病毒檢測注意事項
復(fù)制型腺相關(guān)病毒檢測方法有哪些？正揚生物rcAAV病毒檢測廠家
RCL復(fù)制型慢病毒檢測的背景：CAR-T（chimericantigenreceptorT-cellimmunotherapy），即嵌合抗原受體T細胞免疫療法。它是一種醫(yī)治種瘤的新型精確靶向療法，能夠精確、高效，且有希望治好ai癥的免疫醫(yī)治方法。目前，主要有兩種病毒載體用于CAR-T細胞基因轉(zhuǎn)導(dǎo)：γ逆轉(zhuǎn)錄病毒載體和慢病毒載體。目前基因醫(yī)治產(chǎn)品所用慢病毒載體均是非復(fù)制型的，但在病毒包裝過程中，可能會由于同源或非同源重組等機制產(chǎn)生復(fù)制型慢病毒(RCL)。出于安全、有效、質(zhì)量可控的考慮，應(yīng)當(dāng)對該類病毒進行檢測，以避免在人體內(nèi)無控地自我復(fù)制，造成傷害，防止發(fā)生臨床安全性隱患事件。正揚生物rcAAV病毒檢測廠家