將待測DNA經(jīng)過亞硫酸鹽處理，通過PCR擴增過程引入T7啟動子序列，經(jīng)T7DNA聚合酶的體外轉(zhuǎn)錄過程得到各樣本RNA產(chǎn)物，經(jīng)堿基特異性酶切處理，得到RNA小片段，并用飛行質(zhì)譜檢測每個片段的分子量，***EpiTYPER程序完成數(shù)據(jù)的自動化處理并報告每個檢測片段的甲基化程度。技術(shù)優(yōu)勢·檢測片段長：擴增片段長度可達500bp·高靈敏度：可發(fā)現(xiàn)低至5%甲基化水平，樣本起始量低至10ng?！ぶ貜?fù)性好：變異系數(shù)CV≤5%?！じ咝詢r比：用384孔板進行PCR反應(yīng)，一個擴增產(chǎn)物可以進行多重CpG位點分析，無需后續(xù)驗證，可直接用于文章發(fā)表。服務(wù)內(nèi)容1.根據(jù)客戶提供的序列信息進行預(yù)評估；2.進行樣本DNA的分離、純化、質(zhì)檢及亞硫酸鹽修飾。3.使用特殊設(shè)計的一對引物擴增樣本，得到帶有T7RNA聚合酶啟動子序列的擴增產(chǎn)物。4.在體外轉(zhuǎn)錄體系中，利用T7RNA聚合酶，將擴增產(chǎn)物轉(zhuǎn)錄為RN**斷。5.利用RNaseA能夠特異性識別并切割RNA中U3’端的特性，將RN**斷切割成攜帶有CpG位點的小片斷。6.使用sequenom®MassArray飛行質(zhì)譜分析系統(tǒng)檢測產(chǎn)物。由于同一片斷中，只有CpG和CpA之間16Da的分子量差別，即質(zhì)譜圖中兩者峰的差距。 DNA甲基化多發(fā)生在CpG二核苷酸中的胞嘧啶的5位碳原子。重慶ATAC技術(shù)服務(wù)售后服務(wù)
cfDNABS-Seq送樣要求一、送樣類型分離好的血漿二、保存方式分離后的血漿，用ml離心管分裝，例如：1ml/管；放-20℃冰箱中保存（短暫保存，1-2周）；放-80℃冰箱中長期保存(1年以內(nèi))；保存期間不能凍融。三、運輸條件干冰運輸：順豐陸運（3-4天時間），夏季10-15公斤干冰；秋冬季10公斤干冰四、抽血要求1、使用Streck**管（不建議使用普通的EDTA-鈉抗凝管），采集10ml外周靜脈血（客戶沒有Streck**管，公司配送）；2、室溫或者放置4℃冰箱中半小時以上，不超過8小時，進行血漿分離步驟五、血漿分離步驟1、4℃條件下以1600g離心10min，離心后將上清（血漿）分裝到2、4℃條件下以16000g離心10min去除殘余細胞，將上清移入新的離心管中，每管分裝1ml;3、血漿樣本存放于-80℃冰箱中保存;使用干冰運輸,提取之前不能凍融。備注1：血漿分離在4℃條件進行，如果客戶沒有冷凍離心機，也可以在室溫條件下進行；備注2：離心后取血漿上清，避免吸取白細胞；通常10ml全血可以獲得4-5ml血漿。 浙江RIP-seq技術(shù)服務(wù)服務(wù)通過甲基化數(shù)據(jù)，篩選疾病耐藥的差異甲基化。
RIP-seqRNAImmunoprecipitation是研究細胞內(nèi)蛋白與RNA相互作用的技術(shù)，是了解轉(zhuǎn)錄后調(diào)控網(wǎng)絡(luò)動態(tài)過程的有力工具，能更有效地發(fā)現(xiàn)miRNA的調(diào)節(jié)靶點。這種技術(shù)運用針對目標蛋白的抗體把相應(yīng)的RNA-蛋白復(fù)合物沉淀下來，然后經(jīng)過分離純化就可以對結(jié)合在復(fù)合物上的RNA進行測序分析。RIP可以看成是普遍使用的染色質(zhì)免疫沉淀RIP技術(shù)的類似應(yīng)用，但由于研究對象是RNA-蛋白復(fù)合物而不是DNA-蛋白復(fù)合物，因此RIP實驗的優(yōu)化條件與ChIP實驗并不相同。RIP實驗下游結(jié)合二代測序技術(shù)稱為RIP-seq，通過高通量測序和分析，深度解析與目標蛋白相互結(jié)合的RNA的區(qū)域或種類和相互作用強弱。應(yīng)用領(lǐng)域1.高效獲取蛋白所結(jié)合的RNA，在全轉(zhuǎn)錄組范圍得到與蛋白有相互作用的RNA，包括mRNA、lncRNA、circRNA、microRNA。2.準確獲取蛋白結(jié)合RNA的特征，通過RNA結(jié)合區(qū)域的富集得到蛋白結(jié)合的RNA位置。3.通過motif分析獲取蛋白結(jié)合序列的偏好性。技術(shù)優(yōu)勢***的確定蛋白質(zhì)在細胞自然狀態(tài)下與RNA結(jié)合的研究手段，可以有效的鑒定一個蛋白是否是RNA結(jié)合蛋白以及RNA結(jié)合蛋白與哪些RNA直接作用，并確定其結(jié)合位點。，得知相互作用RNA的類型。，可通過分析可得知與蛋白作用的RNA序列。
焦磷酸測序(Pyrosequencing)隨著技術(shù)的不斷改進，現(xiàn)在認為焦磷酸測序技術(shù)（Pyrosequencing）是甲基化檢測新的金標準。焦磷酸測序作為一種新的序列分析技術(shù)，能夠快速地檢測甲基化的頻率，對樣品中的甲基化位點進行定性及定量檢測，為甲基化研究提供了新的途徑。在序列延伸過程中，根據(jù)C和T的摻入量來定量確定單個位點的C-T比例。因此，不同位點的甲基化變異就能被準確檢測，并給出精確的甲基化程度的數(shù)據(jù)。QIAGEN公司在焦磷酸測序的應(yīng)用上具有明顯的優(yōu)勢，目前提供三種焦磷酸測序儀器，通量由低到高，適合不同的應(yīng)用。PyroMarkQ24的強項在于可對多達24個樣品進行焦磷酸測序。需要大樣品量的應(yīng)用更適合在PyroMarkQ96ID上進行。在考慮到處理成百上千個樣品所需的大量試劑時，運行通量**化可能會使實驗成本變得很高。而PyroMarkQ96MD裝有一臺高度靈敏的光檢測攝像頭，可以在減少試劑量的情況下對少量的DNA模板進行準確測序。這些不同平臺的推出，對于我們實際研究提供了更有效的檢測手段。 FFPE樣本只需要室溫運輸。
ATAC-seq（AssayforTransposase-AccessibleChromatinwithhighthroughputsequencing）是使用高通量測序?qū)n5轉(zhuǎn)座酶可接近的核染色質(zhì)區(qū)域進行測序分析的一種研究技術(shù)；該技術(shù)由美國斯坦福大學(xué)的研究人員開發(fā)，2013年***發(fā)表在NatureMethods（Buenrostroetal.,2013）。通過轉(zhuǎn)座酶對特定時空下開放的核染色質(zhì)區(qū)域進行切割，獲得在該時空下基因組中所有活躍轉(zhuǎn)錄的調(diào)控序列。應(yīng)用領(lǐng)域，通常并不單獨使用。作為檢測表觀遺傳-染色質(zhì)開放狀態(tài)現(xiàn)象的方式，與樣本基因表達譜緊密相連，從靶標基因的表觀狀態(tài)關(guān)聯(lián)到表達水平，具有強大的數(shù)據(jù)挖掘作用。2.通過關(guān)聯(lián)基因組、外顯子，染色質(zhì)免疫共沉淀（組蛋白修飾或轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合）測序信息，形成：表觀調(diào)控-基因組-基因表達的完整調(diào)控鏈。 甲基化驗證是甲基化研究必不可少的一環(huán)。浙江RIP-seq技術(shù)服務(wù)服務(wù)
DNA異常甲基化與疾病的發(fā)生、發(fā)展有著密切的聯(lián)系。重慶ATAC技術(shù)服務(wù)售后服務(wù)
熒光定量法（Methylight）
這種技術(shù)是在MSP技術(shù)上發(fā)展起來的，在MSP擴增過程中利用熒光染料進行定量。TaqMan? 探針法的應(yīng)用使得該技術(shù)具有更高的精確性。其原理與SNP檢測類似，針對亞硫酸氫鹽處理之后的DN**段，在甲基化位點上會存在單堿基的差異，根據(jù)這種差異進行探針設(shè)計，隨后進行實時定量PCR，就能夠檢測甲基化的差異。這種方法**的優(yōu)勢在于其高敏感性和較高通量，且無需在PCR后電泳、雜交等操作，減少了污染和操作誤差。但是TaqMan? 探針訂購費用較高，適用于少數(shù)位點大量樣本篩選。 重慶ATAC技術(shù)服務(wù)售后服務(wù)