Agilent平臺因?yàn)镸eDIP技術(shù)本身的特點(diǎn)，都不能到達(dá)單堿基的分辨率，而Illumina的Infinium和GoldenGate檢測技術(shù)卻做得到。Illumina的Infinium甲基化檢測技術(shù)來源與前期的SNP檢測，采用的是單堿基延伸的原理。分析利用兩個位點(diǎn)特異的探針檢測這些序列差異的位點(diǎn)，一個探針是為甲基化位點(diǎn)(M磁珠類型)設(shè)計的，而另一個是為未甲基化位點(diǎn)(U磁珠類型)設(shè)計的。探針的單堿基延伸摻入了一個標(biāo)記的ddNTP，它隨后被熒光試劑染色。通過計算甲基化與未甲基化位點(diǎn)的熒光信號比例，可確定檢測位點(diǎn)的甲基化水平。Illumina公司早期推出的InfiniumHumanMethylation27BeadChip芯片覆蓋27,578個CpG位點(diǎn)。這款芯片在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有***的應(yīng)用，除了和**相關(guān)的甲基化篩選之外，也能用于其他疾病相關(guān)甲基化檢測。因此對這款產(chǎn)品，研究者給予了很高的評價，目前此產(chǎn)品已停產(chǎn)，取而代之的是InfiniumHumanMethylation450BeadChip芯片。它以單堿基分辨率覆蓋了基因組中超過45萬個甲基化位點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)了基因區(qū)域和CpG島的***覆蓋。此外，還包括CpG島之外的CpG位點(diǎn)，在人類干細(xì)胞中鑒定出的非CpG甲基化位點(diǎn)，以及**和正常組織中差異表達(dá)的甲基化位點(diǎn)等等。它的高覆蓋度、高通量以及低價格。 N6-甲基脫氧腺苷是原核生物和真核生物的DNA修飾類型之一。上海焦磷酸測序技術(shù)服務(wù)口碑推薦
industryTemplate陜西WGBS技術(shù)服務(wù)共同合作甲基化驗(yàn)證方案是TBS。
甲基化敏感性高分辨率熔解曲線分析(MS-HRM)
通過熔解曲線分析可以將單堿基序列的差異轉(zhuǎn)變成熔解曲線的差異，因此DNA樣本經(jīng)過亞硫酸氫鹽處理后，甲基化與未甲基化DNA會存在序列差異，這種差異可通過熔解曲線分析來發(fā)現(xiàn)。使用該方法進(jìn)行甲基化分析*需一對引物，相對簡單，不過這種方法對儀器的要求頗高，需要帶HRM模塊的熒光定量PCR儀，并且在進(jìn)行實(shí)時定量PCR過程中，需要使用飽和的熒光染料。利用MS-HRM技術(shù)進(jìn)行甲基化檢測只能對檢測片段整體甲基化情況進(jìn)行分析，并不能明確每個CpG位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)。因此這種技術(shù)適用于大量樣本的檢測，篩選出感興趣的CPG位點(diǎn)，然后利用其他方法進(jìn)行單個位點(diǎn)的精確檢測及甲基化程度的精確定量。
6mAIP-Seq送樣要求一、送樣類型基因組DNA、動植物組織(包含藻類等)二、保存方式基因組DNA、動植物組織(包含藻類)：放-20℃冰箱中保存，或者放-80℃冰箱中長期保存(1年以內(nèi))；保存期間避免反復(fù)凍融。三、運(yùn)輸條件1、基因組DNA：冰袋或者干冰運(yùn)輸；2、植物組織(包含藻類)：干冰運(yùn)輸，順豐陸運(yùn)（3-4天時間），夏季10-15公斤干冰；秋冬季10公斤干冰；四、樣本量要求1、基因組DNA：不少于6ug1）提供樣本DNA完整性質(zhì)檢結(jié)果，例如瓊脂糖凝膠電泳或者Agilent2100電泳等；2）提取基因組DNA，要加RNA酶，去除RNA污染;3）提取基因組DNA，溶到TE或者elutionbuffer,避免溶解到純水；樣本體積不超過100ul;4）提供Qubit檢測濃度，基于OD值的檢測方法，例如NanoDrop,會嚴(yán)重高估濃度。2、植物組織(包含藻類)：1g以上;植物組織，不同組織，送樣量不同植物組織：從植物體上，取下新鮮組織，用清水將材料表面的灰塵或泥土沖洗干凈，吸干；取不少于1g葉片等組織，對于果實(shí)等含糖很高的組織，送樣前需要咨詢技術(shù)人員。3、動物組織：30mg以上用預(yù)冷的1×PBS溶液洗掉組織表面殘留的血液；取不少于30mg（1/2綠豆大?。┙M織塊，放置-20℃冰箱中保存，或者放-80℃冰箱中長期保存(1年以內(nèi))。 RRBS開發(fā)的初衷就是為人和哺乳動物，提供全基因組范圍的、高性價比的甲基化檢測金標(biāo)準(zhǔn)方案。
聯(lián)合亞硫酸氫鈉的限制性內(nèi)切酶分析法（COBRA）
這種方法是將亞硫酸氫鹽處理與酶切相結(jié)合來進(jìn)行甲基化檢測。DNA樣本經(jīng)亞硫酸氫鹽處理后，利用PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物純化后用限制性內(nèi)切酶（BstUI）消化。若其識別序列中的C發(fā)生完全甲基化(5mCG5mCG)，則 PCR擴(kuò)增后保留為CGCG，BstU I能夠識別并進(jìn)行切割；若待測序列中，C未發(fā)生甲基化，則PCR后轉(zhuǎn)變?yōu)門GTG，BstUI識別位點(diǎn)丟失，不能進(jìn)行切割。這樣酶切產(chǎn)物再經(jīng)電泳分離、探針雜交、掃描定量后即可計算出原樣本中甲基化的比例。
這種方法**的優(yōu)點(diǎn)就是相對簡單，可進(jìn)行快速定量，且需要的樣本量少。然而，它的局限性也十分明顯，只能獲得特殊酶切位點(diǎn)的甲基化情況，且陰性結(jié)果并不能排除樣品DNA中存在甲基化的可能。 羥甲基化DNA免疫沉淀測序是通過5hmC特異性抗體富集結(jié)合高通量測序技術(shù)。山東單細(xì)胞測序技術(shù)服務(wù)專業(yè)服務(wù)
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甲基化是表觀修飾的重要部分，DNA甲基化可以引起DNA構(gòu)象、穩(wěn)定性及DNA與蛋白質(zhì)相互作用方式的改變，從而影響基因表達(dá)。DNA鏈中含有很多CpG結(jié)構(gòu)，雙鏈DNACpG中的胞嘧啶五位碳原子通常容易被甲基化，基因組中60~90%的CpG都被甲基化，未甲基化的CpG成簇出現(xiàn)在基因啟動子**序列或者轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶可以催化CpG的甲基化反應(yīng)。DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶有兩種，Dnmt1是一種持續(xù)性甲基化轉(zhuǎn)移酶，作用于只有一條鏈甲基化的DNA雙鏈，使其完全甲基化，參與DNA復(fù)制過程中新合成鏈的甲基化修飾；Dnmt3a/Dnmt3b是一種從頭甲基化轉(zhuǎn)移酶，可以在CpG上產(chǎn)生新的甲基化修飾，首先半甲基化，繼而全甲基化，該甲基化轉(zhuǎn)移酶可能參與細(xì)胞生長分化的調(diào)控，在**基因甲基化中起到重要作用。近年來CRISPR/Cas9技術(shù)得到快速發(fā)展，在基因切割活性失活的dCas9的5’端融合一個Dnmt3a，能夠通過dCas9介導(dǎo)特定位點(diǎn)的甲基化修飾，調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)。 上海焦磷酸測序技術(shù)服務(wù)口碑推薦