數(shù)字聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（digitalpolymerchainreaction，dPCR）技術(shù)因具有高靈敏度、受基質(zhì)干擾少等優(yōu)勢(shì)而被廣用于轉(zhuǎn)基因食品檢測(cè)。本研究綜述了數(shù)字PCR技術(shù)的原理、系統(tǒng)各部件的優(yōu)劣勢(shì)，梳理了數(shù)字PCR技術(shù)在轉(zhuǎn)基因檢測(cè)與溯源技術(shù)（標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)）方面的進(jìn)展和發(fā)展趨勢(shì)，以期為轉(zhuǎn)基因食品檢測(cè)領(lǐng)域提供參考依據(jù)。dPCR的擴(kuò)增過程大致上可以分為3步：樣品的分散、樣品的熱循環(huán)擴(kuò)增和樣品的檢測(cè)。對(duì)于數(shù)字PCR儀器系統(tǒng)，各個(gè)部件之間仍然有較大的改進(jìn)空間，要發(fā)揮部件之間的協(xié)同作用是很重要的，而且有持續(xù)研究的價(jià)值。表1中總結(jié)了部分常見的數(shù)字PCR系統(tǒng)的類型，以及相對(duì)在硬件、便攜性、性價(jià)比和自動(dòng)化程度上的比較。全自動(dòng)數(shù)字PCR平臺(tái)，讓數(shù)字PCR真正邁入新時(shí)代，助推數(shù)字PCR普及應(yīng)用。美國(guó)數(shù)字PCR熒光通道
作為時(shí)下的熱點(diǎn)技術(shù)，數(shù)字PCR是將核酸樣品分配到大量單獨(dú)、平行的微反應(yīng)單元（nL，納升級(jí)別）中，使得每個(gè)反應(yīng)單元中盡可能含有1個(gè)模板分子，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行擴(kuò)增、檢測(cè)和分布統(tǒng)計(jì)，從而實(shí)現(xiàn)靶標(biāo)分子的比較 計(jì)數(shù)。（圖：數(shù)字PCR技術(shù)原理）根據(jù)微反應(yīng)單元的不同形式，數(shù)字PCR產(chǎn)品可分為微板式、微滴式和芯片式等。目前，市場(chǎng)上主要的數(shù)字PCR產(chǎn)品主要是基于微滴式和芯片式，如Bio-Rad公司的QX200微滴式系統(tǒng)和ThermoFisher公司的QuantStudio系統(tǒng)等。與一、二代PCR技術(shù)相比，數(shù)字PCR具有很多優(yōu)勢(shì)：一是特異性、靈敏性均有顯著提高；二是在不依賴內(nèi)參和標(biāo)準(zhǔn)曲線的前提下，可直接得到比較 量化指標(biāo)；三是微反應(yīng)單元相互獨(dú)立、封閉，避免了PCR抑制劑及不同核酸分子擴(kuò)增產(chǎn)物間的相互干擾，準(zhǔn)確度和可重復(fù)性較高。華南地區(qū)全自動(dòng)數(shù)字PCR系統(tǒng)臻準(zhǔn)推出新款數(shù)字PCR產(chǎn)品：AccuONE2.0數(shù)字PCR系統(tǒng)。
dPCR的結(jié)果統(tǒng)計(jì)方式有2種，一種是采用標(biāo)記多種顏色，通過不同檢測(cè)通道分辨不同顏色和強(qiáng)度，再根據(jù)分散液滴的數(shù)量計(jì)算待測(cè)基因的含量；另一種采用概率統(tǒng)計(jì)的數(shù)據(jù)處理方法，即通過泊松分布的方法對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。應(yīng)用概率統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)和對(duì)數(shù)據(jù)處理方法的模型直接關(guān)系著結(jié)果的準(zhǔn)確性和分析時(shí)間的長(zhǎng)短。常用的統(tǒng)計(jì)方法是假設(shè)每個(gè)微反應(yīng)單元的體積相同，根據(jù)泊松統(tǒng)計(jì)計(jì)算拷貝數(shù)，公式為：M=-Vx1n（1-x/）其中M是目標(biāo)總拷貝數(shù)量；V是微反應(yīng)單元數(shù)量；x是發(fā)光的微反應(yīng)單元數(shù)量。
相比于cPCR技術(shù)和第二代qPCR技術(shù)，dPCR技術(shù)具有定量，可溯源至SI國(guó)際單位制摩爾；基質(zhì)成分干擾較小[51]；靈敏度高；對(duì)抑制劑的敏感性較低；適合多重轉(zhuǎn)基因檢測(cè)[52.53]，可提高分析效率；實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化簡(jiǎn)單[54]對(duì)實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化的要求較低，適合多重基因檢測(cè)等優(yōu)勢(shì)，可為轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物提供準(zhǔn)確的量值保證，目前dPCR儀器的價(jià)格仍然十分昂貴，但隨著系統(tǒng)加工工藝的改進(jìn)以及使用較便宜的材料，聚合成更小的體積[556]，其價(jià)格將會(huì)不斷的降低，使其應(yīng)用到更多的檢測(cè)中。分散方式與數(shù)量由數(shù)字PCR系統(tǒng)決定，分散體積和結(jié)果表達(dá)方式需要實(shí)驗(yàn)人員在實(shí)驗(yàn)過程中優(yōu)化得到。
PCR已成為分子診斷領(lǐng)域重要的技術(shù)手段之一，占據(jù)分子診斷市場(chǎng)的半壁江山。數(shù)字PCR是一代PCR技術(shù)，也是當(dāng)前靈敏度和定量精度比較高的分子檢測(cè)技術(shù)。但數(shù)字PCR使用成本仍然相對(duì)較高，檢測(cè)靶點(diǎn)數(shù)少（一般≤6靶點(diǎn)/反應(yīng)），阻礙了其在臨床中的大規(guī)模應(yīng)用，提高數(shù)字PCR的多重檢測(cè)能力迫在眉睫。基于熒光通道數(shù)的增加和基于探針濃度梯度增加，均可以在一定程度上提高數(shù)字PCR檢測(cè)重?cái)?shù)，然而只能達(dá)到"線性"增加的目的?；谔结槤舛忍荻鹊亩嘀貦z測(cè)技術(shù)雖然光'f明顯增加多重能力，但由于無(wú)法避免交叉反應(yīng)現(xiàn)象，不能確保獲得位點(diǎn)特異性的分簇，因此穩(wěn)定性不足、靈敏度較差，難以滿足臨床級(jí)別的數(shù)據(jù)要求。而基于創(chuàng)新的且數(shù)字PCR獨(dú)特適用的熒光編碼技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)“指數(shù)”級(jí)的多重檢測(cè)，顛覆性的提高數(shù)字PCR檢測(cè)重?cái)?shù)，覆蓋臨床應(yīng)用多場(chǎng)景需求。目前dPCR中體積優(yōu)化方法以光學(xué)顯微鏡觀測(cè)為主。德國(guó)進(jìn)口數(shù)字PCR生命科學(xué)用品
通過“儀器+試劑”相互配合的方式，打出了數(shù)字PCR檢測(cè)的“組合拳”。美國(guó)數(shù)字PCR熒光通道
相比于qPCR，dPCR在轉(zhuǎn)基因檢測(cè)中具有以下優(yōu)勢(shì)：（1）檢測(cè)靈敏度高：理論上dPCR的靈敏度可達(dá)1個(gè)拷貝，而實(shí)際應(yīng)用中dPCR的小檢出限和比較低定量限數(shù)值非常接近，所以dPCR可以在非常低的目標(biāo)拷貝數(shù)下得到精確的結(jié)果；通常轉(zhuǎn)基因比參考基因（內(nèi)源基因）濃度低很多；（2）前處理簡(jiǎn)單且受基質(zhì)成分干擾較?。篸PCR反應(yīng)效率和精密度受到食品基質(zhì)成分干擾影響較小，可應(yīng)用于混合基質(zhì)樣品中低豐度DNA的檢測(cè)；（3）dPCR對(duì)抑制劑的敏感性較低：由于dPCR結(jié)果表示為“有熒光“或“無(wú)熒光”，即使存在抑制劑降低了熒光強(qiáng)度仍可以表示為“有熒光；（4）適合多重轉(zhuǎn)基因檢測(cè)：食品或飼料提取的DNA中可能包含多種轉(zhuǎn)基因片段，可以進(jìn)行多重dPCR檢測(cè)，提高分析效率。同時(shí)，dPCR可以直接溯源至SI國(guó)際單位制摩爾，適合單一、雙重及多重轉(zhuǎn)基因標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究，一次可識(shí)別不同的轉(zhuǎn)基因區(qū)域。下面詳細(xì)進(jìn)行說明。美國(guó)數(shù)字PCR熒光通道
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