傳統(tǒng)定量PCR方法簡介：1）內(nèi)參照法：在不同的PCR反應(yīng)管中加入已定量的內(nèi)標(biāo)和引物，內(nèi)標(biāo)用基因工程方法合成。上游引物用熒光標(biāo)記，下游引物不標(biāo)記。在模板擴增的同時，內(nèi)標(biāo)也被擴增。在PCR產(chǎn)物中，由于內(nèi)標(biāo)與靶模板的長度不同，二者的擴增產(chǎn)物可用電泳或高效液相分離開來，分別測定其熒光強度，以內(nèi)標(biāo)為對照定量待檢測模板。2）競爭法：選擇由突變克隆產(chǎn)生的含有一個新內(nèi)切位點的外源競爭性模板。在同一反應(yīng)管中，待測樣品與競爭模板用同一對引物同時擴增（其中一個引物為熒光標(biāo)記）。擴增后用內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物，競爭性模板的產(chǎn)物被酶解為兩個片段，而待測模板不被酶切，可通過電泳或高效液相將兩種產(chǎn)物分開，分別測定熒光強度，根據(jù)已知模板推測未知模板的起始拷貝數(shù)。3）PCR－ELISA法：利用地高辛或生物素等標(biāo)記引物，擴增產(chǎn)物被固相板上特異的探針?biāo)Y(jié)合，再加入抗地高辛或生物素酶標(biāo)抗體－辣根過氧化物酶結(jié)合物，終酶使底物顯色。常規(guī)的PCR－ELISA法只是定性實驗，若加入內(nèi)標(biāo)，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，也可實現(xiàn)定量檢測目的。PCR 反應(yīng)中通過控制溫度變化使得核酸分子重復(fù)地解鏈與延伸，從而實現(xiàn)對目的片段的指數(shù)擴增。珠三角相對定量qPCR儀廠家
實時熒光定量PCR技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點檢測的局限，實現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測一次熒光信號的強度，并記錄在電腦軟件之中，通過對每個樣品Ct值的計算，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得定量結(jié)果。因此，實時熒光定量PCR無需內(nèi)標(biāo)是建立在兩個基礎(chǔ)之上的：1）Ct值的重現(xiàn)性PCR循環(huán)在到達(dá)Ct值所在的循環(huán)數(shù)時，剛剛進入真正的指數(shù)擴增期（對數(shù)期），此時微小誤差尚未放大，因此Ct值的重現(xiàn)性極好，即同一模板不同時間擴增或同一時間不同管內(nèi)擴增，得到的Ct值是恒定的。2）Ct值與起始模板的線性關(guān)系由于Ct值與起始模板的對數(shù)存在線性關(guān)系，可利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知樣品進行定量測定，因此，實時熒光定量PCR是一種采用外標(biāo)準(zhǔn)曲線定量的方法。外標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量方法相比內(nèi)標(biāo)法是一種準(zhǔn)確的、值得信賴的科學(xué)方法。利用外標(biāo)準(zhǔn)曲線的實時熒光定量PCR是迄今為止定量準(zhǔn)確，重現(xiàn)性比較好的定量方法，已得到全世界的公認(rèn)，范圍廣用于基因表達(dá)研究、轉(zhuǎn)基因研究，藥物療效考核、病原體檢測等諸多領(lǐng)域。湛江靈敏度qPCR儀廠家q225pcr無需參比染料、無需定期校準(zhǔn)，更加簡化的操作流程與減輕的維護負(fù)擔(dān)只為更好地專注于實驗。
而在指數(shù)增長期，由于底物充足，聚合酶活性高，反應(yīng)產(chǎn)物以指數(shù)形式積累，且與初始模板量存在定量關(guān)系，因此，在該時期對模板起始量進行定量分析準(zhǔn)確且重復(fù)性比較好。Ct值，是在指數(shù)增長期內(nèi)，熒光信號到達(dá)熒光檢測閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)，其中C循環(huán)(Cycle)，t閾值（threshold)。每條擴增曲線的Ct值都與初始模板量的對數(shù)存在線性關(guān)系，初始模板的拷貝數(shù)濃度越高，對應(yīng)的Ct值越小;反之則越大。因此，先根據(jù)已知拷貝數(shù)濃度標(biāo)準(zhǔn)品的擴增曲線擬合出標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，再將樣本擴增曲線的Ct值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程中，便可計算未知樣本初始模板的拷貝數(shù)濃度，從而實現(xiàn)定量分析。
qPCR的熒光標(biāo)記方法分為以SYBR Green I染料法為主的熒光染料嵌合法，以Taqman探針法為主的熒光探針法（Cycling Probe，Molecular Bracon等），淬滅染料引物法。SYBR Green I 是高靈敏度的非特異性雙鏈DNA熒光染料，具有綠色激發(fā)波長。它以非特異性方式結(jié)合在dsDNA雙螺旋小溝區(qū)域。游離的SYBR Green I 只發(fā)出極弱的熒光信號，PCR過程中，當(dāng)擴增生成dsDNA時，SYBR Green I 逐漸與dsDNA結(jié)合，熒光信號被千倍放大，熒光信號的強度與擴增得到的dsDNA的濃度成正比。熒光信號被儀器檢測并采集得到“擴增曲線”，通過熒光信號的強度反映出體系中dsDNA的濃度。終點法檢測（也稱 “讀板檢測”）測量的是PCR循環(huán)結(jié)束時累計的PCR產(chǎn)物量。
PCR反應(yīng)需要五種關(guān)鍵試劑：PCR模板：也稱為模板DNA，需要常規(guī)的試劑盒進行提取。如基因組DNA（gDNA），cDNA和質(zhì)粒DNA。DNA聚合酶：所有PCR反應(yīng)都需要可在高溫下工作的DNA聚合酶。Taq聚合酶是一種常用的酶，它可以在70°C時以60個堿基/秒的速率整合核苷酸，并可以擴增高達(dá)5kb的模板，使其適用于無特殊要求的標(biāo)準(zhǔn)PCR。引物：DNA聚合酶需要短序列的核苷酸，以指示它們需要在哪里開始擴增。在PCR中，這些序列稱為引物，是單鏈DNA的短片段（約15-30個堿基）。脫氧核苷酸三磷酸（dNTPs）：是合成DNA新鏈的基礎(chǔ)，包括四個基本DNA核苷酸（dATP，dCTP，dGTP和dTTP）。PCR緩沖液：PCR緩沖液可確保在整個PCR反應(yīng)過程中保持比較好條件。PCR緩沖液的主要成分包括氯化鎂（MGCl2，充當(dāng)DNA聚合酶的輔助因子），tris-HCl和氯化鉀（在反應(yīng)過程中保持穩(wěn)定的pH值）。目前市面上已經(jīng)有很多成熟的包含PCR緩沖液的Taq聚合酶。使用 PCR 擴增 DNA 是當(dāng)今實驗室的一項基礎(chǔ)技術(shù)，創(chuàng)新不斷將其應(yīng)用范圍從研究實驗室擴展到臨床。廣州準(zhǔn)確qPCR儀報價
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qPCR中的熒光探針是一種短鏈寡核苷酸，帶有熒光基團和淬滅基團，它可以特異結(jié)合目的產(chǎn)物的DNA序列。其檢測原理是熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET），即熒光基團和淬滅基團在目標(biāo)DNA分子擴增過程中因為聚合酶的外切活性從而水解分離使熒光信號的釋放；隨著擴增過程的推進，機器實時檢測增強的熒光信號，從而產(chǎn)生終的熒光擴增曲線。根據(jù)修飾基團標(biāo)記和能量轉(zhuǎn)移方式，可以將探針分為TaqMan探針、分子信標(biāo)和其他探針。TaqMan探針（熒光淬滅水解探針）現(xiàn)今常用的TaqMan探針主要是水解探針，其多是5’端標(biāo)記熒光基團，3’端標(biāo)記淬滅基團的短單鏈寡聚核苷酸。在qPCR反應(yīng)中，基于TaqDNA聚合酶的5’-3’核酸外切酶活性，對TaqMan探針進行切割，使熒光基團和猝滅基團分離，熒光基團發(fā)出的熒光信號不會被淬滅，釋放的熒光信號被機器接收。TaqMan探針的qPCR相比于染料法多了一條TaqMan探針，可以特異性結(jié)合DNA序列，因而具有更好的特異性，但探針合成價格偏高。珠三角相對定量qPCR儀廠家
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