qpcr的檢測(cè)原理：qPCR主要是使用插入染料或熒光探針(例如TaqMan)，利用實(shí)時(shí)積累的熒光信號(hào)監(jiān)測(cè)整個(gè)擴(kuò)增過(guò)程，然后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析。qPCR 主要是依賴(lài)于標(biāo)準(zhǔn)品制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)而去確定未知樣品的濃度，因此是一種相對(duì)定量的方法。隨著PCR的循環(huán)進(jìn)行，染料熒光強(qiáng)度增加，從而檢測(cè)到定量反應(yīng)的DNA。SYBR Green是一種DNA插入染料，范圍廣用于qPCR。雖然SYBR Green方法比探針?lè)椒ū阋?，但是特異性沒(méi)有熒光探針?lè)椒ê谩PCR可用于常規(guī)qPCR所需的標(biāo)準(zhǔn)品定量，具有計(jì)量學(xué)意義 。珠三角靈敏度qPCR儀報(bào)價(jià)
而在指數(shù)增長(zhǎng)期，由于底物充足，聚合酶活性高，反應(yīng)產(chǎn)物以指數(shù)形式積累，且與初始模板量存在定量關(guān)系，因此，在該時(shí)期對(duì)模板起始量進(jìn)行定量分析準(zhǔn)確且重復(fù)性比較好。Ct值，是在指數(shù)增長(zhǎng)期內(nèi)，熒光信號(hào)到達(dá)熒光檢測(cè)閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)，其中C循環(huán)(Cycle)，t閾值（threshold)。每條擴(kuò)增曲線的Ct值都與初始模板量的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系，初始模板的拷貝數(shù)濃度越高，對(duì)應(yīng)的Ct值越小;反之則越大。因此，先根據(jù)已知拷貝數(shù)濃度標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增曲線擬合出標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，再將樣本擴(kuò)增曲線的Ct值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程中，便可計(jì)算未知樣本初始模板的拷貝數(shù)濃度，從而實(shí)現(xiàn)定量分析。華南地區(qū)酷博qPCR儀價(jià)格qPCR 反應(yīng)所需時(shí)間取決于反應(yīng)溶液進(jìn)行變溫所需要的時(shí)間，這過(guò)程受到加熱塊升降溫速度和液體升降溫速度影響。
PCR：Polymerase chain reaction. 是體外模擬生物的DNA 復(fù)制。需要DNA 聚合酶，DNA 模板，兩端引物，脫氧核苷酸dNTPs( dATP, ACTP, dGTP, dTTP),以及適當(dāng)?shù)木彌_體系。PCR 產(chǎn)物的增長(zhǎng)形式為２N (如果各種試劑和外部所加條件均理想化，N 是循環(huán)數(shù))。實(shí)際中，擴(kuò)增效率不為100％。Real time PCR 是定量PCR 的一種，當(dāng)然是在PCR 的基礎(chǔ)上發(fā)展出來(lái)的。（普通）PCR 包含很多因素，屬性，如：試劑，溫度，循環(huán)數(shù)，程序，PCR 產(chǎn)物（擴(kuò)增子，amplicon）的量，擴(kuò)增曲線（擴(kuò)增子累積曲線），摻錯(cuò)率，擴(kuò)增子長(zhǎng)度。一般來(lái)說(shuō)，人們關(guān)心的是擴(kuò)增子的量。而real time PCR 主要利用的是擴(kuò)增曲線（amplification curve）, 循環(huán)數(shù)；擴(kuò)增子長(zhǎng)度，擴(kuò)增效率，擴(kuò)增子多少，也加以考慮。
定量首先需要建立Ct值和拷貝數(shù)之間的線性關(guān)系，即標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)曲需要由標(biāo)準(zhǔn)品生成，標(biāo)準(zhǔn)品中基因序列要與待測(cè)樣品中基因序列一致，從而保證引物在兩者中擴(kuò)增效率完全相同，標(biāo)準(zhǔn)品來(lái)源可以是質(zhì)粒，純化的PCR產(chǎn)物或者基因組DNA等。標(biāo)準(zhǔn)品在加樣時(shí)需要注意體積比較好大于2微升，以減少標(biāo)曲誤差，標(biāo)曲是由不同梯度標(biāo)準(zhǔn)品生成，每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品梯度建立Ct值與拷貝數(shù)對(duì)數(shù)值之間的聯(lián)系，落在標(biāo)曲上的梯度點(diǎn)比較好有5個(gè)及以上，至少3個(gè)點(diǎn)。標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣品同時(shí)反應(yīng)，將待測(cè)樣品檢測(cè)的Ct值代入標(biāo)曲后即可換算出待測(cè)樣品中基因的拷貝數(shù)。。q225 所使用的熱循環(huán)系統(tǒng)峰值變溫速率可達(dá)4°C/s。
qPCR的熒光標(biāo)記方法分為以SYBR Green I染料法為主的熒光染料嵌合法，以Taqman探針?lè)橹鞯臒晒馓结樂(lè)ǎ–ycling Probe，Molecular Bracon等），淬滅染料引物法。SYBR Green I 是高靈敏度的非特異性雙鏈DNA熒光染料，具有綠色激發(fā)波長(zhǎng)。它以非特異性方式結(jié)合在dsDNA雙螺旋小溝區(qū)域。游離的SYBR Green I 只發(fā)出極弱的熒光信號(hào)，PCR過(guò)程中，當(dāng)擴(kuò)增生成dsDNA時(shí)，SYBR Green I 逐漸與dsDNA結(jié)合，熒光信號(hào)被千倍放大，熒光信號(hào)的強(qiáng)度與擴(kuò)增得到的dsDNA的濃度成正比。熒光信號(hào)被儀器檢測(cè)并采集得到“擴(kuò)增曲線”，通過(guò)熒光信號(hào)的強(qiáng)度反映出體系中dsDNA的濃度。QPCR用于基因表達(dá)研究、轉(zhuǎn)基因研究，藥物療效考核、病原體檢測(cè)等諸多領(lǐng)域。蘇州單通道qPCR儀作用
qPCR在原有PCR基礎(chǔ)上與熒光檢測(cè)方法結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)。珠三角靈敏度qPCR儀報(bào)價(jià)
所有儀器的操作都基本一致。設(shè)置的時(shí)候包括反應(yīng)板設(shè)置（plate setup）和程序設(shè)置（program setup）。我們以 ABI StepOne為例，詳細(xì)看一下反應(yīng)設(shè)置：A. 首先是實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇：定量還是其他。我們命名為“BioTeke”，進(jìn)行“定量”實(shí)驗(yàn)。B. 實(shí)驗(yàn)方法的選擇：我們選用的比較Ct的SYBR Green方法， Fast程序，以cDNA為模板進(jìn)行。C. 目的基因的設(shè)置：有幾個(gè)目的基因和目的基因的名稱(chēng)。D. 樣品的設(shè)置：包括哪個(gè)是實(shí)驗(yàn)組，哪個(gè)是對(duì)照組。以及負(fù)對(duì)照的設(shè)置和生物重復(fù)的設(shè)置。E. 對(duì)照組和內(nèi)參基因的設(shè)置：這個(gè)是為后面的定量做準(zhǔn)備F. 反應(yīng)程序的設(shè)置：PCR反應(yīng)程序的設(shè)置要根據(jù)不同公司的MasterMix。比如BioTeke的95℃ 2分鐘就可以DNA聚合酶（ABI的需要10 分鐘）。循環(huán)反應(yīng)是95℃15秒，60℃15秒的40個(gè)循環(huán)。溶解曲線程序采用儀器默認(rèn)設(shè)置就可以?；蛘呤莾x器說(shuō)明書(shū)上建議的程序。G. 反應(yīng)體系的設(shè)置：A-G這五個(gè)步驟簡(jiǎn)單設(shè)置好，可以保存，修改反應(yīng)程序或者立刻進(jìn)行反應(yīng)。
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