所謂實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號積累實(shí)時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。實(shí)時熒光定量PCR （Quantitative Real-time PCR）是一種在DNA擴(kuò)增反應(yīng)中，以熒光化學(xué)物質(zhì)測每次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）循環(huán)后產(chǎn)物總量的方法。通過內(nèi)參或者外參法對待測樣品中的特定DNA序列進(jìn)行定量分析的方法?！eal-timePCR是在PCR擴(kuò)增過程中，通過熒光信號，對PCR進(jìn)程進(jìn)行實(shí)時檢測。由于在PCR擴(kuò)增的指數(shù)時期，模板的Ct值和該模板的起始拷貝數(shù)存在線性關(guān)系，所以成為定量的依據(jù)。Quantagene q225 系列熒光定量PCR 系統(tǒng)主要特點(diǎn)：精確定量、快速高效、小巧輕便。湛江熒光定量qPCR儀應(yīng)用
傳統(tǒng)定量PCR方法簡介：1）內(nèi)參照法：在不同的PCR反應(yīng)管中加入已定量的內(nèi)標(biāo)和引物，內(nèi)標(biāo)用基因工程方法合成。上游引物用熒光標(biāo)記，下游引物不標(biāo)記。在模板擴(kuò)增的同時，內(nèi)標(biāo)也被擴(kuò)增。在PCR產(chǎn)物中，由于內(nèi)標(biāo)與靶模板的長度不同，二者的擴(kuò)增產(chǎn)物可用電泳或高效液相分離開來，分別測定其熒光強(qiáng)度，以內(nèi)標(biāo)為對照定量待檢測模板。2）競爭法：選擇由突變克隆產(chǎn)生的含有一個新內(nèi)切位點(diǎn)的外源競爭性模板。在同一反應(yīng)管中，待測樣品與競爭模板用同一對引物同時擴(kuò)增（其中一個引物為熒光標(biāo)記）。擴(kuò)增后用內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物，競爭性模板的產(chǎn)物被酶解為兩個片段，而待測模板不被酶切，可通過電泳或高效液相將兩種產(chǎn)物分開，分別測定熒光強(qiáng)度，根據(jù)已知模板推測未知模板的起始拷貝數(shù)。3）PCR－ELISA法：利用地高辛或生物素等標(biāo)記引物，擴(kuò)增產(chǎn)物被固相板上特異的探針?biāo)Y(jié)合，再加入抗地高辛或生物素酶標(biāo)抗體－辣根過氧化物酶結(jié)合物，終酶使底物顯色。常規(guī)的PCR－ELISA法只是定性實(shí)驗(yàn)，若加入內(nèi)標(biāo)，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，也可實(shí)現(xiàn)定量檢測目的。上海高效qPCR儀消毒SYBR Green是一種DNA插入染料用于qPCR。雖然SYBR Green方法比探針方法便宜，但是特異性沒有熒光探針方法好。
合成引物時需注意：在設(shè)計(jì)PCR引物時，首先確定要擴(kuò)增的DNA區(qū)域，并設(shè)計(jì)一對專門位于目標(biāo)區(qū)域的引物，一個在正向鏈上，另一個在反向鏈上。引物須具有特異性，避免擴(kuò)增出非特異性片段。正向引物與反向引物應(yīng)具有相似的退火溫度，GC含量與退火溫度相關(guān)，調(diào)整引物長度可以改變退火溫度。避免引物序列有二級結(jié)構(gòu)或引物二聚體，會降低PCR效率。許多的在線工具可用于輔助引物設(shè)計(jì)。PCR擴(kuò)增包括三組被設(shè)定好的時間和溫度，步驟為：變性，退火和延伸1、變性：PCR的第一步稱為變性，將模板DNA加熱到95°C幾秒鐘，將兩條DNA鏈分開，使它們之間的氫鍵迅速斷裂。2、退火：反應(yīng)混合物冷卻30秒至1分鐘。退火溫度通常為50-65°C，但確切的比較好溫度取決于引物的長度和順序。不同的引物可能具有不同的退火溫度。3、延伸：溫度升至混合物中存在的DNA聚合酶的理想工作溫度，通常約為72°C。DNA聚合酶附著在每個引物的一端，并合成與模板DNA互補(bǔ)的DNA新鏈。
實(shí)時熒光定量PCR所使用的熒光物質(zhì)可分為兩種：熒光探針和熒光染料?，F(xiàn)將其原理簡述如下：1. TaqMan熒光探針：PCR擴(kuò)增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個報(bào)告熒光基團(tuán)和一個淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號被淬滅基團(tuán)吸收；PCR擴(kuò)增時，Taq酶的5'－3'外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。2. SYBR熒光染料：在PCR反應(yīng)體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料非特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后，發(fā)射熒光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發(fā)射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。SYBR與雙鏈DNA進(jìn)行結(jié)合，因此可以通過溶解曲線，確定PCR反應(yīng)是否特異。3.分子信標(biāo)：是一種在5和3末端自身形成一個8個堿基左右的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的莖環(huán)雙標(biāo)記寡核苷酸探針，兩端的核酸序列互補(bǔ)配對，導(dǎo)致熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)緊緊靠近，不會產(chǎn)生熒光。PCR產(chǎn)物生成后，退火過程中，分子信標(biāo)中間部分與特定DNA序列配對，熒光基因與淬滅基因分離產(chǎn)生熒光。qPCR只能實(shí)現(xiàn)相對定量，即必須使用標(biāo)準(zhǔn)品生成標(biāo)準(zhǔn)曲線，才能進(jìn)行定量。
TaqMan qPCR：該測定不使用嵌入染料，而是使用帶有 5' 熒光報(bào)告染料和 3' 淬滅染料的 TaqMan 探針。 這些探針是目標(biāo)特異性的，并且在退火步驟中與引物之一下游的目標(biāo) DNA 序列結(jié)合。 當(dāng) Taq 聚合酶在延伸階段遇到 TaqMan 探針時，它會置換并切割 5' 報(bào)告染料。 一旦報(bào)告染料與淬滅染料分離，其在每個 qPCR 循環(huán)結(jié)束時的可測量熒光信號就會顯著增加。 第二條 DNA 鏈?zhǔn)瞧叫泻铣傻?，但由于沒有探針附著在它上面，因此無法通過熒光測量來監(jiān)測這一過程。與 SYBR Green 檢測相比，使用 TaqMan 探針的成本更高，但也具有兩個顯著優(yōu)勢：TaqMan 檢測測量目標(biāo)序列的擴(kuò)增進(jìn)程，因?yàn)樘结樖悄繕?biāo)特異性的。您可以通過向主混合物中添加不同的引物和具有不同報(bào)告染料的 TaqMan 探針來監(jiān)測單個反應(yīng)中各種 qPCR 產(chǎn)物的數(shù)量。 這種多重方法允許您在每個熱循環(huán)結(jié)束時檢測多個熒光信號。qPCR面對小的差異較弱，dPCR則可識別差異較小的拷貝數(shù)。珠海Quantagene q225qPCR儀消毒
利用外標(biāo)準(zhǔn)曲線的實(shí)時熒光定量PCR是迄今為止定量準(zhǔn)確，重現(xiàn)性比較好的定量方法，已得到全世界的公認(rèn)。湛江熒光定量qPCR儀應(yīng)用
qpcr的檢測原理：qPCR主要是使用插入染料或熒光探針(例如TaqMan)，利用實(shí)時積累的熒光信號監(jiān)測整個擴(kuò)增過程，然后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線來對未知模板進(jìn)行定量分析。qPCR 主要是依賴于標(biāo)準(zhǔn)品制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)而去確定未知樣品的濃度，因此是一種相對定量的方法。隨著PCR的循環(huán)進(jìn)行，染料熒光強(qiáng)度增加，從而檢測到定量反應(yīng)的DNA。SYBR Green是一種DNA插入染料，范圍廣用于qPCR。雖然SYBR Green方法比探針方法便宜，但是特異性沒有熒光探針方法好。湛江熒光定量qPCR儀應(yīng)用
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