利用SYBR Green I可以檢測PCR反應(yīng)中獲得的全部雙鏈DNA,但是不能區(qū)分不同的雙鏈DNA。為了進(jìn)一步確保熒光檢測的就是靶DNA序列，人們又設(shè)計(jì)了能與目的DNA序列特異結(jié)合的熒光探針，如TaqMan探針。TaqMan探針是一小段被設(shè)計(jì)成可以與靶DNA序列中間部位結(jié)合的單鏈DNA（一般為50-150 bp）,并且該單鏈DNA的5'和3'端帶有短波長和長波長兩個(gè)不同熒光基團(tuán)。這兩個(gè)熒光基團(tuán)由于距離過近，在熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）作用下發(fā)生熒光淬滅，因而檢測不到熒光。PCR反應(yīng)開始后，隨著雙鏈DNA變性產(chǎn)生單鏈DNA，TaqMan探針結(jié)合到與之配對的靶DNA序列上，并被具有外切酶活性的Taq DNA聚合酶逐個(gè)切除而降解，從而解除熒光淬滅的束縛，熒光基團(tuán)在激發(fā)光下發(fā)岀熒光，所產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度直接反映了被擴(kuò)增的靶DNA總量。qPCR面對小的差異較弱，dPCR則可識(shí)別差異較小的拷貝數(shù)。熒光定量qPCR儀型號(hào)
檢測原理：將一個(gè)樣本分成幾十到幾萬份，再將其分配到不同的反應(yīng)單元中，使每個(gè)微滴單元包含一個(gè)或多個(gè)拷貝的核酸分子（即DNA模板），每個(gè)單元都會(huì)對目標(biāo)分子進(jìn)行擴(kuò)增，檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)強(qiáng)度，帶入泊松分布即可計(jì)算出起始模板DNA濃度。dPCR原理:微滴式數(shù)字PCR檢測流程：其方法與qPCR類似，分為以下幾步。:1、DNA提取2、DNA濃度檢測并稀釋。3、配置PCR反應(yīng)液。4、上機(jī)到PCR儀中進(jìn)行檢測。5、PCR擴(kuò)增。6、結(jié)果判讀。使用微滴數(shù)字PCR儀逐個(gè)對每個(gè)微滴進(jìn)行檢測，有熒光信號(hào)的微滴判讀為1，沒有熒光信號(hào)的微滴判讀為0，終根據(jù)泊松分布原理以及陽性微滴的比例，計(jì)算出DNA濃度。
珠三角小巧qPCR儀使用說明實(shí)時(shí)熒光定量PCR是一種采用外標(biāo)準(zhǔn)曲線定量的方法。
1983年，美國化學(xué)家Kary Mullis發(fā)明了聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)(polymerase chain reaction， PCR)，這一技術(shù)將DNA聚合酶的特性結(jié)合核酸雙鏈的變性復(fù)性特性，采用適溫延伸、高溫變性以及低溫復(fù)性，讓目的核酸片段實(shí)現(xiàn)了特異性體外擴(kuò)增，可將極微量的目標(biāo)DNA特異地?cái)U(kuò)增上百萬倍，從而提高對DNA分子的分析和檢測靈敏度。尤其是耐熱DNA聚合酶的發(fā)現(xiàn)，更是極大地促進(jìn)了PCR技術(shù)在分子生物學(xué)科研，及臨床分子診斷領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用。常用的 PCR 技術(shù)包括逆轉(zhuǎn)錄PCR（Reverse Transcription PCR，RT-PCR）和實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real-time Quantitative PCR，qPCR）等。
所有儀器的操作都基本一致。設(shè)置的時(shí)候包括反應(yīng)板設(shè)置（plate setup）和程序設(shè)置（program setup）。我們以 ABI StepOne為例，詳細(xì)看一下反應(yīng)設(shè)置：A. 首先是實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇：定量還是其他。我們命名為“BioTeke”，進(jìn)行“定量”實(shí)驗(yàn)。B. 實(shí)驗(yàn)方法的選擇：我們選用的比較Ct的SYBR Green方法， Fast程序，以cDNA為模板進(jìn)行。C. 目的基因的設(shè)置：有幾個(gè)目的基因和目的基因的名稱。D. 樣品的設(shè)置：包括哪個(gè)是實(shí)驗(yàn)組，哪個(gè)是對照組。以及負(fù)對照的設(shè)置和生物重復(fù)的設(shè)置。E. 對照組和內(nèi)參基因的設(shè)置：這個(gè)是為后面的定量做準(zhǔn)備F. 反應(yīng)程序的設(shè)置：PCR反應(yīng)程序的設(shè)置要根據(jù)不同公司的MasterMix。比如BioTeke的95℃ 2分鐘就可以DNA聚合酶（ABI的需要10 分鐘）。循環(huán)反應(yīng)是95℃15秒，60℃15秒的40個(gè)循環(huán)。溶解曲線程序采用儀器默認(rèn)設(shè)置就可以?；蛘呤莾x器說明書上建議的程序。G. 反應(yīng)體系的設(shè)置：A-G這五個(gè)步驟簡單設(shè)置好，可以保存，修改反應(yīng)程序或者立刻進(jìn)行反應(yīng)。
qpcr在擴(kuò)增每個(gè)循環(huán)中模板DNA通過變性、復(fù)性、延伸三個(gè)階段形成更多的子代DNA，為下一個(gè)循環(huán)提供模板DNA。
定量方法包括相對定量和定量，兩者的重要差異在于相對定量的結(jié)果是差異性的結(jié)果，涉及比較；而定量的結(jié)果是一個(gè)具體數(shù)值，對于基因表達(dá)量而言是基因的拷貝數(shù)，不涉及任何比較。相對定量首先需要確定一個(gè)內(nèi)參基因，內(nèi)參基因作用有檢測樣本材料中RNA是否降解、糾正樣本加樣的差異、校正cDNA合成速率差異及校正PCR抑制劑的影響，其本質(zhì)作用是利用內(nèi)參基因的Ct值對目的基因的Ct值進(jìn)行均一化處理，常用的內(nèi)參基因包括DH、β-actin、18S rRNA，使用的時(shí)候需要注意其序列必須是物種本身的特異序列，雖然其比較保守，但不同物種也會(huì)存在堿基差別。另外，相對定量需要確定參照物，因?yàn)樯婕氨容^，參照物選擇不同，所得的定量結(jié)果可能完全相反，經(jīng)常選擇的參照物一般是對照組或未處理組。QPCR用于基因表達(dá)研究、轉(zhuǎn)基因研究，藥物療效考核、病原體檢測等諸多領(lǐng)域。珠三角小巧qPCR儀使用說明
在進(jìn)行大量SNP標(biāo)記分型時(shí)無需合成熒光探針和熒光引物。可以的節(jié)省實(shí)驗(yàn)成本。熒光定量qPCR儀型號(hào)
qPCR的實(shí)質(zhì)就是PCR反應(yīng)，只是在擴(kuò)增產(chǎn)物上增加了熒光標(biāo)記，通過儀器對熒光信號(hào)進(jìn)行采集。熒光信號(hào)的強(qiáng)度與擴(kuò)增得到的dsDNA的濃度成正比，因此非理想條件下的PCR熒光強(qiáng)度Rn=R0+YnRs＝RB+Y0(1+Ex)^nRs （Rn：第n次循環(huán)時(shí)熒光信號(hào)強(qiáng)度，R0：背景信號(hào)強(qiáng)度，Rs：每個(gè)分子的熒光強(qiáng)度），通過對采集熒光信號(hào)就能進(jìn)行初始模板定量、基因表達(dá)量的研究。通過對PCR過程中熒光信號(hào)的實(shí)時(shí)監(jiān)測，熒光強(qiáng)度的變化趨勢，呈現(xiàn)出一條S型曲線即“擴(kuò)增曲線（Amplication plot）”，分為四個(gè)時(shí)期：基線期、指數(shù)擴(kuò)增期、線性增長期、平臺(tái)期。熒光定量qPCR儀型號(hào)
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