qPCR技術(shù)的本質(zhì)是PCR技術(shù)，在擴(kuò)增的每個(gè)循環(huán)中模板DNA通過變性、復(fù)性、延伸三個(gè)階段形成更多數(shù)量的子代DNA，為下一個(gè)循環(huán)提供模板DNA。在每個(gè)循環(huán)結(jié)束后，儀器會(huì)激發(fā)熒光物質(zhì)并檢測(cè)一次熒光信號(hào)，那么每一個(gè)循環(huán)都會(huì)對(duì)應(yīng)一個(gè)熒光信號(hào)值，將所有熒光信號(hào)值用光滑的曲線進(jìn)行連接起來，便是 qPCR擴(kuò)增曲線。如圖所示，根據(jù)qPCR擴(kuò)增曲線整體趨勢(shì)，整個(gè)擴(kuò)增過程主要分為四個(gè)時(shí)期，分別是基線期、指數(shù)增長期、線性增長期和平臺(tái)期。在基線期和平臺(tái)期，熒光信號(hào)均維持水平狀態(tài)，均不適用于對(duì)初始模板進(jìn)行定量分析。在線性增長期，雖然擴(kuò)增反應(yīng)仍在進(jìn)行，但隨著反應(yīng)產(chǎn)物的積累，PCR反應(yīng)受到明顯抑制導(dǎo)致擴(kuò)增效率不斷降低，此時(shí)產(chǎn)物不再以指數(shù)形式增長，同樣不適用于定量分析初始模板量。根據(jù)qPCR擴(kuò)增曲線整體趨勢(shì)，整個(gè)擴(kuò)增過程主要分為四個(gè)時(shí)期，基線期、指數(shù)增長期、線性增長期和平臺(tái)期。佛山qPCR儀設(shè)置
交聯(lián)和裂解——穩(wěn)定復(fù)合物并分離核組分:第一步對(duì)時(shí)間要求嚴(yán)格并且需要優(yōu)化。體內(nèi)共價(jià)交聯(lián)穩(wěn)定蛋白質(zhì)-DNA相互作用并于特定時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行分析。通常采用甲醛交聯(lián)，加入甘氨酸以終止反應(yīng)。交聯(lián)劑滲透到完整細(xì)胞中并將蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物鎖定在一起從而進(jìn)行分析。交聯(lián)劑在整個(gè)過程中保持復(fù)合物穩(wěn)定，但其作用必須是可逆的才能用于ChIP。一些非常穩(wěn)定的蛋白質(zhì)-DNA相互作用則不需要交聯(lián)。接下來，使用裂解液透化細(xì)胞膜，釋放細(xì)胞組分，然后蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物變得可溶。去除細(xì)胞溶質(zhì)蛋白以減少背景信號(hào)并增加靈敏度。注意：此時(shí)可以停止ChIP測(cè)定。 經(jīng)過交聯(lián)，淬滅和洗滌細(xì)胞沉淀后，將裂解物于-80℃儲(chǔ)存。Quantagene q225mxqPCR儀采購qPCR通過內(nèi)參或者外參法對(duì)待測(cè)樣品中的特定DNA序列進(jìn)行定量分析的方法。
qPCR和dPCR:研究人員已經(jīng)通過兩種方式克服了定量PCR分析的挑戰(zhàn)：實(shí)時(shí)定量PCR(qPCR)和數(shù)字PCR(dPCR)。qPCR主要使用插入染料或熒光探針(例如TaqMan)。通過監(jiān)測(cè)PCR期間的熒光強(qiáng)度，可以比較多個(gè)樣品的DNA水平。數(shù)字PCR(dPCR)的基本工作原理很簡單。先將樣品分為多個(gè)PCR反應(yīng)，每個(gè)反應(yīng)多包含一個(gè)模板。然后通過對(duì)陽性和陰性反應(yīng)進(jìn)行計(jì)數(shù)來確定初始樣品中模板分子的數(shù)量。盡管qPCR和dPCR都能夠定量樣品中的核酸，但它們有一個(gè)重要的區(qū)別。qPCR只能實(shí)現(xiàn)相對(duì)定量(例如，樣品A的目標(biāo)序列是樣品B的目標(biāo)序列的兩倍)，除非使用此標(biāo)準(zhǔn)生成標(biāo)準(zhǔn)曲線。數(shù)字PCR本身是定量的，不需要標(biāo)準(zhǔn)曲線。另一方面，qPCR技術(shù)更加成熟和眾所周知，市場(chǎng)上有大量商業(yè)產(chǎn)品可供選擇。dPCR仍然是小的新鮮肉。它不如qPCR使用且價(jià)格昂貴。與dPCR相比，qPCR更適合于高通量分析，并且動(dòng)態(tài)范圍廣。
染色質(zhì)片段化——DN段化:細(xì)胞核材料片段化是獲得良好的ChIP 分辨率的關(guān)鍵因素，理想情況下的片段大小在 200 到 800 bp對(duì)之間。剪切是難控制的步驟之一。通過超聲處理和/或核酸酶/酶促消化可以實(shí)現(xiàn)剪切，各有利弊。超聲處理需要大量的手動(dòng)操作時(shí)間，但非常適合難以裂解的細(xì)胞；酶促消化不需要手動(dòng)操作，適用于大量樣品的處理，但其剪切位點(diǎn)不是隨機(jī)的。兩種方法都需要根據(jù)具體細(xì)胞系進(jìn)行優(yōu)化。注意：此時(shí)可以停止ChIP。經(jīng)過剪切/消化染色質(zhì)后，可以將樣品于-80°C儲(chǔ)存。避免反復(fù)凍融。在進(jìn)行大量SNP標(biāo)記分型時(shí)無需合成熒光探針和熒光引物。可以的節(jié)省實(shí)驗(yàn)成本。
傳統(tǒng)定量PCR方法簡介：1）內(nèi)參照法：在不同的PCR反應(yīng)管中加入已定量的內(nèi)標(biāo)和引物，內(nèi)標(biāo)用基因工程方法合成。上游引物用熒光標(biāo)記，下游引物不標(biāo)記。在模板擴(kuò)增的同時(shí)，內(nèi)標(biāo)也被擴(kuò)增。在PCR產(chǎn)物中，由于內(nèi)標(biāo)與靶模板的長度不同，二者的擴(kuò)增產(chǎn)物可用電泳或高效液相分離開來，分別測(cè)定其熒光強(qiáng)度，以內(nèi)標(biāo)為對(duì)照定量待檢測(cè)模板。2）競爭法：選擇由突變克隆產(chǎn)生的含有一個(gè)新內(nèi)切位點(diǎn)的外源競爭性模板。在同一反應(yīng)管中，待測(cè)樣品與競爭模板用同一對(duì)引物同時(shí)擴(kuò)增（其中一個(gè)引物為熒光標(biāo)記）。擴(kuò)增后用內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物，競爭性模板的產(chǎn)物被酶解為兩個(gè)片段，而待測(cè)模板不被酶切，可通過電泳或高效液相將兩種產(chǎn)物分開，分別測(cè)定熒光強(qiáng)度，根據(jù)已知模板推測(cè)未知模板的起始拷貝數(shù)。3）PCR－ELISA法：利用地高辛或生物素等標(biāo)記引物，擴(kuò)增產(chǎn)物被固相板上特異的探針?biāo)Y(jié)合，再加入抗地高辛或生物素酶標(biāo)抗體－辣根過氧化物酶結(jié)合物，終酶使底物顯色。常規(guī)的PCR－ELISA法只是定性實(shí)驗(yàn)，若加入內(nèi)標(biāo)，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，也可實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)目的。熒光檢測(cè)系統(tǒng)可接收熒光信號(hào)，每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，熒光信號(hào)累積和PCR產(chǎn)物形成是同步。華南地區(qū)快速qPCR儀設(shè)置
TaqMan方法通過采用熒光探針在PCR循環(huán)過程中隨著特定PCR產(chǎn)物的累計(jì)而對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)。佛山qPCR儀設(shè)置
在擴(kuò)增曲線上，指定某個(gè)熒光強(qiáng)度值時(shí)可對(duì)應(yīng)得到達(dá)到這個(gè)值所需的循環(huán)數(shù)。選擇合適的熒光強(qiáng)度值，該值的水平線可以切割到所有處于指數(shù)增長期的擴(kuò)增曲線，這樣的熒光強(qiáng)度值稱為熒光閾值（threshold）。在熒光進(jìn)入指數(shù)期初階段的熒光強(qiáng)度值符合這一特點(diǎn)。一般PCR擴(kuò)增的初始循環(huán)（默認(rèn)3~15個(gè)循環(huán)），熒光信號(hào)變化不大，接近直線，稱為基線（baseline），所以通常儀器默認(rèn)的閾值是PCR反應(yīng)~15個(gè)循環(huán)（熒光本底信號(hào)）的熒光信號(hào)標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。當(dāng)然，實(shí)際還需要結(jié)合PCR擴(kuò)增效率、線性回歸系數(shù)等綜合考慮。也可以將閾值手動(dòng)設(shè)置為大于熒光背景值和陰性對(duì)照（NTC）的熒光比較高值之間（進(jìn)入指數(shù)期的初階段）。佛山qPCR儀設(shè)置
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