作為時(shí)下的熱點(diǎn)技術(shù)，數(shù)字PCR是將核酸樣品分配到大量單獨(dú)、平行的微反應(yīng)單元（nL，納升級(jí)別）中，使得每個(gè)反應(yīng)單元中盡可能含有1個(gè)模板分子，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行擴(kuò)增、檢測(cè)和分布統(tǒng)計(jì)，從而實(shí)現(xiàn)靶標(biāo)分子的比較 計(jì)數(shù)。（圖：數(shù)字PCR技術(shù)原理）根據(jù)微反應(yīng)單元的不同形式，數(shù)字PCR產(chǎn)品可分為微板式、微滴式和芯片式等。目前，市場(chǎng)上主要的數(shù)字PCR產(chǎn)品主要是基于微滴式和芯片式，如Bio-Rad公司的QX200微滴式系統(tǒng)和ThermoFisher公司的QuantStudio系統(tǒng)等。與一、二代PCR技術(shù)相比，數(shù)字PCR具有很多優(yōu)勢(shì)：一是特異性、靈敏性均有顯著提高；二是在不依賴內(nèi)參和標(biāo)準(zhǔn)曲線的前提下，可直接得到比較 量化指標(biāo)；三是微反應(yīng)單元相互獨(dú)立、封閉，避免了PCR抑制劑及不同核酸分子擴(kuò)增產(chǎn)物間的相互干擾，準(zhǔn)確度和可重復(fù)性較高。數(shù)字PCR適用于依靠Ct值不能很好分辨的應(yīng)用領(lǐng)域。美國(guó)全自動(dòng)數(shù)字PCR價(jià)格
微滴數(shù)字PCR主要是將兩種互不相溶的液體，以其中一種作為連續(xù)相（油），另一種作為分散相（水），在水/油兩相表面張力和剪切共同作用下分散相以微小體積單元的形式存在于連續(xù)中，從而成液滴。這種液滴式的反應(yīng)腔室具有體積小、樣品間無(wú)擴(kuò)散等優(yōu)勢(shì)。在ddPCR中，利用微滴發(fā)生器可以一次生成數(shù)萬(wàn)乃至百萬(wàn)個(gè)納升甚至皮升級(jí)別的單個(gè)油包水微滴，作為數(shù)字PCR的樣品分散載體。這里，液滴中包裹了單拷貝DNA模板和PCR反應(yīng)液，然后將液滴收集在PCR反應(yīng)管中進(jìn)行擴(kuò)增。?PCR反應(yīng)結(jié)束后檢測(cè)每個(gè)微滴的熒光信號(hào)。目前Bio-Rad公司的QX100系統(tǒng)、QX200系統(tǒng)均為采用液滴技術(shù)的數(shù)字PCR系統(tǒng)。圖6.Bio-Rad的液滴數(shù)字PCR系統(tǒng)美國(guó)全自動(dòng)數(shù)字PCR價(jià)格PCR本質(zhì)上是將一個(gè)傳統(tǒng)的PCR反應(yīng)分成了數(shù)萬(wàn)個(gè)PCR反應(yīng)。
產(chǎn)物越短，往往擴(kuò)增效率越高。模板二級(jí)結(jié)構(gòu)（Templatesecondarystructure）：PCR變性中和變性后的單鏈DNA不夠穩(wěn)定，容易自發(fā)折疊形成二級(jí)結(jié)構(gòu)。應(yīng)避免可形成穩(wěn)定二級(jí)結(jié)構(gòu)的模板鏈區(qū)域，因?yàn)槿绻０彐溞纬傻亩?jí)結(jié)構(gòu)在退火溫度下穩(wěn)定存在，定位在模板鏈二級(jí)結(jié)構(gòu)處的引物將無(wú)法同模板鏈相結(jié)合。使用mfold可預(yù)測(cè)引物待結(jié)合的區(qū)域是否存在復(fù)雜的二級(jí)結(jié)構(gòu)。設(shè)計(jì)引物時(shí)，盡量使引物定位在模板二級(jí)結(jié)構(gòu)以外的序列上。避免具有4個(gè)以上相同的連續(xù)堿基的區(qū)域（Avoid>4repeatsofsamebases）：以避免延伸階段聚合酶“滑動(dòng)（PolymeraseSlippage）”。選擇GC含量（GCContent）在50-60%之間的區(qū)域。如果高GC含量區(qū)域不可避免，可以嘗試提高退火溫度，并使用添加劑，例如甘油，
在PCR進(jìn)行的過(guò)程中，首先是引物和探針?lè)謩e結(jié)合，然后開(kāi)始擴(kuò)增。如果一個(gè)微滴當(dāng)中有目標(biāo)基因的片段，Taqman探針就會(huì)被酶切碎，熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)分離。在后面的檢測(cè)過(guò)程中，熒光基團(tuán)被激發(fā)光路激發(fā)之后就會(huì)發(fā)熒光。如果沒(méi)有，Taqman探針就不會(huì)被切碎，在后面的檢測(cè)過(guò)程中，熒光基團(tuán)吸收到激發(fā)光的能量，就會(huì)被淬滅基團(tuán)給淬滅，那么儀器就檢測(cè)不到這個(gè)微滴的信號(hào)。檢測(cè)的過(guò)程中，并不是說(shuō)一個(gè)樣本中檢測(cè)到了幾個(gè)亮點(diǎn)，這個(gè)反應(yīng)當(dāng)中就有幾個(gè)目標(biāo)基因的拷貝。因?yàn)槟繕?biāo)基因的片段，在微滴當(dāng)中的分布，是符合泊松分布的（也就是說(shuō)進(jìn)不進(jìn)的概率相等，并且相互獨(dú)立）。所以，一個(gè)發(fā)光的微滴中，可能有一個(gè)或者三個(gè)四個(gè)，甚至更多個(gè)目標(biāo)基因的拷貝。因此，發(fā)光的微滴數(shù)與原始的基因拷貝數(shù)并不是一對(duì)一的對(duì)應(yīng)關(guān)系。通過(guò)“儀器+試劑”相互配合的方式，打出了數(shù)字PCR檢測(cè)的“組合拳”。
面對(duì)日益嚴(yán)格的限量標(biāo)準(zhǔn)和可預(yù)期降低的儀器購(gòu)置成本，數(shù)字PCR將在食品檢測(cè)領(lǐng)域起到越來(lái)越重要的作用：同時(shí)，數(shù)字PCR技術(shù)帶來(lái)的量值的溯源方式，也將成為轉(zhuǎn)基因標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的主要研究方向。發(fā)展dPCR協(xié)同分析和自動(dòng)化程度，使其具有更好兼容性、更低廉的成本，可使數(shù)據(jù)結(jié)果不間斷地納入到全食品安全全產(chǎn)業(yè)鏈中，從而在未來(lái)的食品檢測(cè)中得到更廣的應(yīng)用。dPCR多重檢測(cè)可在不使用標(biāo)準(zhǔn)曲線的情況下，在同一分析過(guò)程中同時(shí)測(cè)定單一或多個(gè)轉(zhuǎn)基因與參考基因的比率，提高檢測(cè)的效率節(jié)省重復(fù)操作。數(shù)字PCR應(yīng)用前景廣闊，可用于病原微生物檢測(cè)、基因檢測(cè)、無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前篩查、測(cè)序結(jié)果驗(yàn)證等領(lǐng)域。深圳微滴式數(shù)字PCR性能特點(diǎn)
數(shù)字PCR是通過(guò)將一個(gè)樣本分成幾十到幾萬(wàn)份，分配到不同的反應(yīng)單元，每個(gè)單元至少包含一個(gè)拷貝的目標(biāo)分子 。美國(guó)全自動(dòng)數(shù)字PCR價(jià)格
數(shù)字PCR產(chǎn)品的發(fā)展，為不同場(chǎng)景下的多樣化核酸檢測(cè)需求提供了新的思路，尤其是在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)方面，在 性疾病早期檢測(cè)、病癥的液體活檢、無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前檢查等領(lǐng)域展現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。實(shí)現(xiàn) 性疾病早期高效檢測(cè)——以病毒為例，有病毒檢測(cè)、和臨床樣本病毒載量評(píng)估He監(jiān)測(cè)環(huán)境病毒載量；二代熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)是目前病毒檢測(cè)的"金標(biāo)準(zhǔn)"，但由于病毒探針結(jié)合位點(diǎn)突變、樣本病毒載量不足等原因，在臨床檢測(cè)過(guò)程中經(jīng)常出現(xiàn)假陰性結(jié)果，由于數(shù)字PCR具有更高的靈敏度、精細(xì)度，以及其適合痕量樣本檢測(cè)的特性，能夠檢測(cè)出熒光定量PCR檢測(cè)過(guò)程中錯(cuò)過(guò)的 ，可作為后者的補(bǔ)充。在人群篩查及臨床診療中，為科學(xué)選取采樣方式，需要評(píng)估不同臨床樣本病毒載量，如鼻咽拭子、血尿、糞便、肺泡灌洗液等，由于數(shù)字PCR可提供一定程度上量化指標(biāo)，為采樣方法的選取提供了參考，從而提高檢出率。在外防輸入的戰(zhàn)略要求下，環(huán)境病毒檢測(cè)工作尤為重要，數(shù)字PCR可對(duì)低核酸豐度樣本進(jìn)行有效檢測(cè)，包括從不同環(huán)境中取樣的樣本，如病房、醫(yī)院衛(wèi)生間、實(shí)驗(yàn)室等等，在病情防控中起到了不可忽視的作用。此外，數(shù)字PCR的應(yīng)用場(chǎng)景還有病程不同階段的病毒載量評(píng)估、核酸參考品制備、抗病毒藥物研發(fā)等環(huán)節(jié)。美國(guó)全自動(dòng)數(shù)字PCR價(jià)格
廣州雙螺旋科學(xué)儀器有限公司致力于精細(xì)化學(xué)品，是一家服務(wù)型公司。公司業(yè)務(wù)分為數(shù)字PCR，純水機(jī)，病理切片機(jī)，倍性分析儀等，目前不斷進(jìn)行創(chuàng)新和服務(wù)改進(jìn)，為客戶提供良好的產(chǎn)品和服務(wù)。公司秉持誠(chéng)信為本的經(jīng)營(yíng)理念，在精細(xì)化學(xué)品深耕多年，以技術(shù)為先導(dǎo)，以自主產(chǎn)品為重點(diǎn)，發(fā)揮人才優(yōu)勢(shì)，打造精細(xì)化學(xué)品良好品牌。雙螺旋科學(xué)儀器秉承“客戶為尊、服務(wù)為榮、創(chuàng)意為先、技術(shù)為實(shí)”的經(jīng)營(yíng)理念，全力打造公司的重點(diǎn)競(jìng)爭(zhēng)力。