數(shù)字PCR技術(shù)的出現(xiàn)不是為了完全取代原有分子診斷技術(shù)，而是更好的補(bǔ)充和完善現(xiàn)有技術(shù)平臺(tái)。數(shù)字PCR為不同應(yīng)用場(chǎng)景下的多樣化核酸檢測(cè)需求提供了新的思路，尤其是在臨床檢測(cè)方面，在 性疾病早期檢測(cè)、 疾病的伴隨診斷、生殖遺傳篩查等領(lǐng)域展現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。國(guó)產(chǎn)數(shù)字PCR企業(yè)在商業(yè)化應(yīng)用方面，也不斷“攻城略地”。新羿生物在檢測(cè)及 疾病伴隨診斷方面開發(fā)了一系列試劑盒，并積極推進(jìn)注冊(cè)臨床試驗(yàn)；領(lǐng)航基因聚焦在血流 （膿毒癥）及呼吸道 領(lǐng)域，相繼推出了多款病原菌檢測(cè)試劑盒；銳訊生物聚焦于檢測(cè)，2020年其產(chǎn)品獲得FDA緊急授權(quán)。除此之外，在公共衛(wèi)生領(lǐng)域，國(guó)產(chǎn)數(shù)字PCR企業(yè)針對(duì)食源性致病菌、鼠疫、蟲媒病毒等，也推出多種檢測(cè)試劑盒。在dPCR中，樣品被分區(qū)，使得樣品內(nèi)單個(gè)的核酸分子被定位并被集中在許多分離的區(qū)域內(nèi)。深圳賽默飛數(shù)字PCR原理
引物設(shè)計(jì)（DesignPrimers）：引物長(zhǎng)度（PrimerLength）：18-25個(gè)堿基之間。短的引物更易于同靶序列結(jié)合，但過短的引物也更可能同基因組上的多個(gè)區(qū)域相結(jié)合而產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物。更長(zhǎng)的引物會(huì)提高同靶序列結(jié)合的特異性，但過長(zhǎng)的引物（>30bp）同靶序列結(jié)合速度變慢，降低結(jié)合率。引物長(zhǎng)度和組成直接影響引物Tm值（PrimerMeltingTemperature）和退火溫度（AnnealingTemperatures）。引物的組成——GC%含量（GCContent）：指引物總堿基中G和C堿基數(shù)量的百分比，該值應(yīng)在40-60%之間。如果模板序列的GC含量較高，推薦使用較高Tm值的引物。華南地區(qū)全自動(dòng)數(shù)字PCR市場(chǎng)前景數(shù)字PCR的兩大應(yīng)用場(chǎng)景在于基因檢測(cè)、無創(chuàng)出生缺陷篩查。
了解泊松分布，我們先要從二項(xiàng)式分布說起，二項(xiàng)式分布是一個(gè)離散概率分布，它給出了m次試驗(yàn)中k次成功的可能性，每次試驗(yàn)的概率為p，例如當(dāng)擲骰子時(shí)，二項(xiàng)分布給出了在10次試驗(yàn)中恰好有7次擲出4的概率。在數(shù)字PCR的情況中，投擲骰子類似于將一個(gè)目標(biāo)實(shí)體隨機(jī)“投擲”到一組分區(qū)中，當(dāng)目標(biāo)落在選定的分區(qū)中時(shí)，就是成功。如果有n個(gè)分區(qū)，并且分區(qū)過程是完全隨機(jī)的，則目標(biāo)出現(xiàn)在所選分區(qū)中的概率為1/n。該試驗(yàn)重復(fù)m次，樣品中的每個(gè)分子一次。如下所示的二項(xiàng)式分布給出了k個(gè)成功的概率，即所選分區(qū)恰好包含k個(gè)分子的概率。數(shù)字PCR通常采用大量分區(qū)。當(dāng)n很大，并且嘗試成功的概率(1/n)很小時(shí)，二項(xiàng)分布可以近似為泊松分布。
基于微滴的QX100dPCR儀，利用油包水技術(shù)，將樣品平均分配到20000個(gè)微滴油包水中，利用微滴分析儀對(duì)微滴進(jìn)行分析。2012年RainDance公司推出了RainDropdPCR儀，在高壓氣體驅(qū)動(dòng)下，將每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系分割成包含100萬至1000萬個(gè)皮升級(jí)別微滴的反應(yīng)乳液。數(shù)字PCR就形成了2大派別，芯片式和微滴式。不論是哪種數(shù)字PCR，其原理都是有限稀釋，終點(diǎn)PCR和泊松分布。將含有核酸模板的標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)體系，平均分配成幾萬個(gè)PCR反應(yīng)，分配到芯片或微滴中，使每個(gè)反應(yīng)中盡可能含有一個(gè)模板分子，進(jìn)行單分子模板PCR反應(yīng)，通過讀取熒光信號(hào)的有或無進(jìn)行計(jì)數(shù)，經(jīng)過統(tǒng)計(jì)學(xué)泊松分布的校準(zhǔn)進(jìn)行定量。數(shù)字PCR適用于依靠Ct值不能很好分辨的應(yīng)用領(lǐng)域。
數(shù)字PCR系統(tǒng)通過其獨(dú)特的微流體陣列式芯片板（MAP）技術(shù)，提供強(qiáng)大而易于使用的數(shù)字PCR體驗(yàn)。這種專有技術(shù)可實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品進(jìn)行一致的自動(dòng)腔室化，可將一份樣品腔室化至20,000個(gè)微反應(yīng)室，其變異系數(shù)（CV）達(dá)到比較好的<1%。與其它數(shù)字PCR系統(tǒng)不同，MAP技術(shù)不使用乳液或其它基于液滴的方法對(duì)反應(yīng)進(jìn)行腔室化。而是利用分配通道將試劑遞送至微反應(yīng)室，具有高精密度和一致性。此外，QuantStudioAbsoluteQ系統(tǒng)可分析加載樣品的95%以上，確保獲得高度準(zhǔn)確的數(shù)字PCR結(jié)果。從市場(chǎng)規(guī)模來看，目前數(shù)字PCR市場(chǎng)規(guī)模并不大，全球約1.5億至2.5億美元。廣州醫(yī)療系統(tǒng)認(rèn)證數(shù)字PCR油滴制造
通過創(chuàng)新技術(shù)微流控芯片，讓數(shù)字PCR單反應(yīng)耗材價(jià)格進(jìn)入個(gè)位數(shù)，實(shí)現(xiàn)了新的進(jìn)步，也降低開發(fā)難度。深圳賽默飛數(shù)字PCR原理
數(shù)字聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（digitalpolymerchainreaction，dPCR）技術(shù)因具有高靈敏度、受基質(zhì)干擾少等優(yōu)勢(shì)而被廣用于轉(zhuǎn)基因食品檢測(cè)。本研究綜述了數(shù)字PCR技術(shù)的原理、系統(tǒng)各部件的優(yōu)劣勢(shì)，梳理了數(shù)字PCR技術(shù)在轉(zhuǎn)基因檢測(cè)與溯源技術(shù)（標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)）方面的進(jìn)展和發(fā)展趨勢(shì)，以期為轉(zhuǎn)基因食品檢測(cè)領(lǐng)域提供參考依據(jù)。dPCR的擴(kuò)增過程大致上可以分為3步：樣品的分散、樣品的熱循環(huán)擴(kuò)增和樣品的檢測(cè)。對(duì)于數(shù)字PCR儀器系統(tǒng)，各個(gè)部件之間仍然有較大的改進(jìn)空間，要發(fā)揮部件之間的協(xié)同作用是很重要的，而且有持續(xù)研究的價(jià)值。表1中總結(jié)了部分常見的數(shù)字PCR系統(tǒng)的類型，以及相對(duì)在硬件、便攜性、性價(jià)比和自動(dòng)化程度上的比較。深圳賽默飛數(shù)字PCR原理
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