產物越短，往往擴增效率越高。模板二級結構（Templatesecondarystructure）：PCR變性中和變性后的單鏈DNA不夠穩(wěn)定，容易自發(fā)折疊形成二級結構。應避免可形成穩(wěn)定二級結構的模板鏈區(qū)域，因為如果模板鏈形成的二級結構在退火溫度下穩(wěn)定存在，定位在模板鏈二級結構處的引物將無法同模板鏈相結合。使用mfold可預測引物待結合的區(qū)域是否存在復雜的二級結構。設計引物時，盡量使引物定位在模板二級結構以外的序列上。避免具有4個以上相同的連續(xù)堿基的區(qū)域（Avoid>4repeatsofsamebases）：以避免延伸階段聚合酶“滑動（PolymeraseSlippage）”。選擇GC含量（GCContent）在50-60%之間的區(qū)域。如果高GC含量區(qū)域不可避免，可以嘗試提高退火溫度，并使用添加劑，例如甘油，模板 DNA 量越多，熒光達到域值的循環(huán)數(shù)越少，即 Ct 值越小。法國臻準數(shù)字PCR解決方案
dPCR的測量結果通常表示為含量，即拷貝數(shù)值或轉基因質量百分比，而QPCR結果通常表示為拷貝數(shù)的質量分數(shù)。目前市場上可購買到大多數(shù)轉基因標準物質，以qPCR定值的標準物質是以拷貝數(shù)（單倍體基因組當量）的質量分數(shù)來表示特性量；以dPCR定值的標準物質直接采用拷貝數(shù)比例來表示特性量。不同方法使用不同的表示方式，會造成測量結果不可比。因此質量分數(shù)、拷貝數(shù)和拷貝數(shù)比例之間的關系需要轉化，才能得到單位一致，數(shù)值可比的數(shù)據(jù)。EU聯(lián)合研究中心建議使用轉換因子從拷貝數(shù)換算到質量分數(shù)。法國一體化數(shù)字PCR技術數(shù)字PCR在檢測珍貴樣品和樣品核酸存在降解時具有明顯的優(yōu)勢。
相比于cPCR技術和第二代qPCR技術，dPCR技術具有定量，可溯源至SI國際單位制摩爾；基質成分干擾較小[51]；靈敏度高；對抑制劑的敏感性較低；適合多重轉基因檢測[52.53]，可提高分析效率；實驗條件優(yōu)化簡單[54]對實驗條件優(yōu)化的要求較低，適合多重基因檢測等優(yōu)勢，可為轉基因農作物提供準確的量值保證，目前dPCR儀器的價格仍然十分昂貴，但隨著系統(tǒng)加工工藝的改進以及使用較便宜的材料，聚合成更小的體積[556]，其價格將會不斷的降低，使其應用到更多的檢測中。
對于檢測需要高靈敏度以及技術確認的情況下，數(shù)字PCR技術也可以發(fā)揮重要作用。技術數(shù)據(jù)表明，數(shù)字PCR技術對的比較低檢測下限可到2copies/ml，比qPCR靈敏度提升了100倍。經(jīng)測試，數(shù)字PCR在檢測和診斷的某些方面優(yōu)于金標準qPCR，尤其是在低病毒載量樣本中，相比起qPCR，數(shù)字PCR特異性、靈敏度、重現(xiàn)性和檢測限受影響更小。因此，未來預計數(shù)字PCR技術也將在類疾病中得到更加廣的應用。數(shù)字PCR的應用甚廣，除了可應用于進行突變的檢測以外，也可運用于基因擴增的檢測。通過數(shù)字PCR技術可建立多重熒光體系，用于同時檢測比如非小細胞肺中常見的MET和HER2耐藥擴增。有研究報道，使用數(shù)字PCR技術對436例非小細胞肺樣品進行檢測，并挑選樣本驗證了數(shù)字PCR與RNA fish的檢測一致性。結果表明，該數(shù)字PCR技術在保證了基因擴增檢測準確性的同時，還節(jié)約了檢測時間。三重ddPCR檢測體系存在的問題：不同位點檢測體系之間的cross-reactivity。
了解泊松分布，我們先要從二項式分布說起，二項式分布是一個離散概率分布，它給出了m次試驗中k次成功的可能性，每次試驗的概率為p，例如當擲骰子時，二項分布給出了在10次試驗中恰好有7次擲出4的概率。在數(shù)字PCR的情況中，投擲骰子類似于將一個目標實體隨機“投擲”到一組分區(qū)中，當目標落在選定的分區(qū)中時，就是成功。如果有n個分區(qū)，并且分區(qū)過程是完全隨機的，則目標出現(xiàn)在所選分區(qū)中的概率為1/n。該試驗重復m次，樣品中的每個分子一次。如下所示的二項式分布給出了k個成功的概率，即所選分區(qū)恰好包含k個分子的概率。數(shù)字PCR通常采用大量分區(qū)。當n很大，并且嘗試成功的概率(1/n)很小時，二項分布可以近似為泊松分布。dPCR可直接溯源SI國際單位制摩爾，適合單一、雙重及多重轉基因標準物質研究，一次可識別不同的轉基因區(qū)域。蘇州臻準數(shù)字PCR分析應用
通過創(chuàng)新技術微流控芯片，讓數(shù)字PCR單反應耗材價格進入個位數(shù)，實現(xiàn)了新的進步，也降低開發(fā)難度。法國臻準數(shù)字PCR解決方案
目前dPCR主要有兩種形式，芯片式和液滴式，但基本原理都是將大量稀釋后的核酸溶液分散至芯片的微反應器或微滴中，每個反應器的核酸模板數(shù)少于或者等于1個。這樣經(jīng)過PCR循環(huán)之后，有一個核酸分子模板的反應器就會給出熒光信號，沒有模板的反應器就沒有熒光信號。根據(jù)相對比例和反應器的體積，就可以推算出原始溶液的核酸濃度?？梢允褂脦追N不同的方法來分配樣品，包括微孔板，毛細管，油乳劑和帶有核酸結合表面的小型化腔室陣列。樣品的分配使人們可以通過假設分子種群遵循泊松分布來估計不同分子的數(shù)量，根據(jù)泊松分布的原理，反應體系中目標分子的拷貝數(shù)可以通過公式A=-ln[(N-X)/N]*N計算，從而解決了多個目標分子存在于單個液滴中的可能性。法國臻準數(shù)字PCR解決方案
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