目前dPCR主要有兩種形式，芯片式和液滴式，但基本原理都是將大量稀釋后的核酸溶液分散至芯片的微反應(yīng)器或微滴中，每個(gè)反應(yīng)器的核酸模板數(shù)少于或者等于1個(gè)。這樣經(jīng)過PCR循環(huán)之后，有一個(gè)核酸分子模板的反應(yīng)器就會(huì)給出熒光信號(hào)，沒有模板的反應(yīng)器就沒有熒光信號(hào)。根據(jù)相對(duì)比例和反應(yīng)器的體積，就可以推算出原始溶液的核酸濃度?？梢允褂脦追N不同的方法來分配樣品，包括微孔板，毛細(xì)管，油乳劑和帶有核酸結(jié)合表面的小型化腔室陣列。樣品的分配使人們可以通過假設(shè)分子種群遵循泊松分布來估計(jì)不同分子的數(shù)量，根據(jù)泊松分布的原理，反應(yīng)體系中目標(biāo)分子的拷貝數(shù)可以通過公式A=-ln[(N-X)/N]*N計(jì)算，從而解決了多個(gè)目標(biāo)分子存在于單個(gè)液滴中的可能性。我國數(shù)字PCR市場的整體規(guī)模、公司影響力、行業(yè)話語權(quán)等也將迎來進(jìn)一步提升，從而助推行業(yè)高質(zhì)量創(chuàng)新發(fā)展。美國賽默飛數(shù)字PCR性能特點(diǎn)
Drop-off實(shí)驗(yàn)包括兩個(gè)針對(duì)相同擴(kuò)增子的TaqMan探針：與野生型序列互補(bǔ)而與突變位點(diǎn)不發(fā)生互補(bǔ)的Drop-off探針和與突變型和野生型基因都互補(bǔ)的Reference探針（如圖1A）。在野生型等位基因的存在下，Drop-off探針和Reference探針都將與目標(biāo)雜交，產(chǎn)生雙重陽性信號(hào)（如圖1B，藍(lán)色群）。相反，如果存在突變的等位基因，即使一個(gè)核苷酸的突變也會(huì)阻止Drop-off探針與之雜交，因此只有Reference探針對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行退火，從而得到一個(gè)陽性信號(hào)。蘇州數(shù)字PCR原理全自動(dòng)數(shù)字PCR一體機(jī)可以適用于包括醫(yī)療檢測(cè)領(lǐng)域在內(nèi)的多種應(yīng)用場景。
數(shù)字PCR系統(tǒng)的分散方式?jīng)Q定了分散數(shù)量，其結(jié)果基于統(tǒng)計(jì)的方法進(jìn)行定量，增加反應(yīng)單元數(shù)量（統(tǒng)計(jì)樣本量），可以增加其檢測(cè)的容量和動(dòng)態(tài)檢測(cè)線性范圍達(dá)到和qPCR相近的動(dòng)態(tài)范圍，同時(shí)減小一個(gè)反應(yīng)單元中包含多個(gè)分子所造成的誤差，達(dá)到提高靈敏度和準(zhǔn)確度。影響dPCR定量結(jié)果的因素包括：儀器采用的分散方式與數(shù)量、溶液稀釋方法、分散體積的準(zhǔn)確性以及結(jié)果表達(dá)方式。分散方式與數(shù)量由數(shù)字PCR系統(tǒng)決定，分散體積和結(jié)果表達(dá)方式需要實(shí)驗(yàn)人員在實(shí)驗(yàn)過程中優(yōu)化得到。
相比于cPCR技術(shù)和第二代qPCR技術(shù)，dPCR技術(shù)具有定量，可溯源至SI國際單位制摩爾；基質(zhì)成分干擾較小[51]；靈敏度高；對(duì)抑制劑的敏感性較低；適合多重轉(zhuǎn)基因檢測(cè)[52.53]，可提高分析效率；實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化簡單[54]對(duì)實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化的要求較低，適合多重基因檢測(cè)等優(yōu)勢(shì)，可為轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物提供準(zhǔn)確的量值保證，目前dPCR儀器的價(jià)格仍然十分昂貴，但隨著系統(tǒng)加工工藝的改進(jìn)以及使用較便宜的材料，聚合成更小的體積[556]，其價(jià)格將會(huì)不斷的降低，使其應(yīng)用到更多的檢測(cè)中。dPCR的結(jié)果統(tǒng)計(jì)方式有2種，一種是采用標(biāo)記多種顏色，另一種采用概率統(tǒng)計(jì)的數(shù)據(jù)處理方法。
dPCR的測(cè)量結(jié)果通常表示為含量，即拷貝數(shù)值或轉(zhuǎn)基因質(zhì)量百分比，而QPCR結(jié)果通常表示為拷貝數(shù)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。目前市場上可購買到大多數(shù)轉(zhuǎn)基因標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，以qPCR定值的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是以拷貝數(shù)（單倍體基因組當(dāng)量）的質(zhì)量分?jǐn)?shù)來表示特性量；以dPCR定值的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)直接采用拷貝數(shù)比例來表示特性量。不同方法使用不同的表示方式，會(huì)造成測(cè)量結(jié)果不可比。因此質(zhì)量分?jǐn)?shù)、拷貝數(shù)和拷貝數(shù)比例之間的關(guān)系需要轉(zhuǎn)化，才能得到單位一致，數(shù)值可比的數(shù)據(jù)。EU聯(lián)合研究中心建議使用轉(zhuǎn)換因子從拷貝數(shù)換算到質(zhì)量分?jǐn)?shù)。在使用dPCR進(jìn)行轉(zhuǎn)基因檢測(cè)時(shí)，通常直接參照qPCR的方法。一體化數(shù)字PCR樣品回收
通過數(shù)字PCR技術(shù)可建立多重?zé)晒怏w系，用于同時(shí)檢測(cè)比如非小細(xì)胞中常見的MET和HER2耐藥擴(kuò)增。美國賽默飛數(shù)字PCR性能特點(diǎn)
由于現(xiàn)有的商業(yè)化數(shù)字PCR設(shè)備在物理上只設(shè)置了2個(gè)檢測(cè)通道，所以存在一個(gè)明顯的短板：不能同時(shí)進(jìn)行多個(gè)位點(diǎn)的檢測(cè)。在樣品多位點(diǎn)的檢測(cè)中，就需要更多的起始樣品，但臨床上組織的樣品非常有限。相比之下熒光定量PCR儀上就很容易實(shí)現(xiàn)多重檢測(cè)。為了考察利用數(shù)字PCR實(shí)現(xiàn)多重檢測(cè)的可能性，英國TheInstituteofCancerResearch的研究人員以非小細(xì)胞肺相關(guān)的KRAS基因?yàn)闄z測(cè)對(duì)象，在Bio-Rad的數(shù)字PCR系統(tǒng)上通過3個(gè)三重ddPCR檢測(cè)體系來實(shí)現(xiàn)9個(gè)KRAS突變位點(diǎn)的檢測(cè)。美國賽默飛數(shù)字PCR性能特點(diǎn)
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