在定量PCR時，我們常常糾結(jié)一個問題，究竟是相對定量還是***定量呢？如今，你無需糾結(jié)了，因為數(shù)字PCR（digitalPCR）來了。盡管這兩種技術(shù)有些類似，都是估計起始樣品中的核酸量，但它們有一個重要的區(qū)別。定量PCR是依靠標(biāo)準(zhǔn)曲線或參照基因來測定核酸量，而數(shù)字PCR則讓你能夠直接數(shù)出DNA分子的個數(shù)，是對起始樣品的***定量。因此特別適用于依靠Ct值不能很好分辨的應(yīng)用領(lǐng)域：拷貝數(shù)變異、突變檢測、基因相對表達研究（如等位基因不平衡表達）、二代測序結(jié)果驗證、miRNA表達分析、單細胞基因表達分析等。通過不同cluster的位置進行突變位點的判斷時存在誤判的現(xiàn)象。珠三角數(shù)字PCR熒光通道
Drop-off實驗包括兩個針對相同擴增子的TaqMan探針：與野生型序列互補而與突變位點不發(fā)生互補的Drop-off探針和與突變型和野生型基因都互補的Reference探針（如圖1A）。在野生型等位基因的存在下，Drop-off探針和Reference探針都將與目標(biāo)雜交，產(chǎn)生雙重陽性信號（如圖1B，藍色群）。相反，如果存在突變的等位基因，即使一個核苷酸的突變也會阻止Drop-off探針與之雜交，因此只有Reference探針對目標(biāo)基因進行退火，從而得到一個陽性信號。蘇州一體化數(shù)字PCR品牌dPCR可直接溯源SI國際單位制摩爾，適合單一、雙重及多重轉(zhuǎn)基因標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究，一次可識別不同的轉(zhuǎn)基因區(qū)域。
基于數(shù)字PCR技術(shù)平臺，塔歌生物成功地開發(fā)了胎兒染色體非整倍體(T21,T18和T13)無創(chuàng)產(chǎn)前篩查試劑盒（數(shù)字PCR-NIPT），并已完成數(shù)百例臨床樣本驗證。數(shù)字PCR-NIPT的陽性檢出率和NGS相似，且成本接近血清學(xué)，可以在上述應(yīng)急策略中取代血清學(xué)作為靈敏度和特異性更高的初篩方法，以有效提高陽性檢出率，降低需要復(fù)篩的假陽性樣本數(shù)和節(jié)省總的篩查成本。數(shù)字PCR應(yīng)用前景廣闊，可用于病原微生物檢測、基因檢測、無創(chuàng)產(chǎn)前篩查、測序結(jié)果驗證等領(lǐng)域。但目前，大多數(shù)醫(yī)院采購的數(shù)字PCR儀器是用于科研層面，在臨床應(yīng)用上仍處于起步階段，未得到普遍應(yīng)用。
數(shù)字PCR平臺的評價指標(biāo)有：分割單元數(shù)，熒光通道數(shù)，操作復(fù)雜性和污染風(fēng)險。但是重要的是檢測準(zhǔn)確性，評估數(shù)字PCR平臺的一種方法是使用多個數(shù)字PCR平臺互相驗證，另一種方法是使用定值準(zhǔn)確的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。目前的三代的PCR技術(shù)各有各的優(yōu)缺點，也各有各的應(yīng)用領(lǐng)域，并不是一代取代一代的關(guān)系。技術(shù)的不斷進步給PCR技術(shù)注入了新的活力，使其能解鎖一個又一個的應(yīng)用方向，使核酸檢測更方便、更準(zhǔn)確。目前dPCR儀器的價格仍然十分昂貴，但隨著系統(tǒng)加工工藝的改進以及使用較便宜的材料，聚合成更小的體積[556]，其價格將會不斷的降低，使其應(yīng)用到更多的檢測中。全自動數(shù)字PCR一體機可以適用于包括醫(yī)療檢測領(lǐng)域在內(nèi)的多種應(yīng)用場景。
在使用dPCR進行轉(zhuǎn)基因檢測時，通常直接參照qPCR的方法。使用不同技術(shù)對相同樣品檢測時，兩種方法的靈敏度是否具有可比性成為關(guān)注的問題。Burns等21]使用Fluidigm公司的12.765（12板，每板765個微單元）芯片數(shù)字PCR分析儀測定標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)ERM-AD413檢測轉(zhuǎn)基因玉米MON810。該小組應(yīng)用dPCR技術(shù)評估在qPCR定義下的靈敏度數(shù)值，在拷貝數(shù)200-700之間，dPCR與qPCR的測量結(jié)果具有一致性。但與qPCR的靈敏度相比，dPCR在低于拷貝數(shù)200時有被低估的風(fēng)險，在高于拷貝數(shù)1000時有被高估的風(fēng)險。dPCR在同一陣列上同時測量轉(zhuǎn)基因和內(nèi)源性靶點時，需要稀釋內(nèi)源性靶點和轉(zhuǎn)基因靶點在合理拷貝數(shù)范圍內(nèi)以保證dPCR測量結(jié)果的準(zhǔn)確性。通過創(chuàng)新技術(shù)微流控芯片，讓數(shù)字PCR單反應(yīng)耗材價格進入個位數(shù)，實現(xiàn)了新的進步，也降低開發(fā)難度。臻準(zhǔn)數(shù)字PCR
楊雁峰博士堅信數(shù)字PCR是可以應(yīng)用于無創(chuàng)產(chǎn)前篩查的理想技術(shù)之一，這也是他2016年創(chuàng)立塔歌生物的初衷。珠三角數(shù)字PCR熒光通道
數(shù)字PCR實驗步驟包括：1）試劑配制：將10xdPCRBuffer、dPCR酶、引物和探針、無核酸酶水混合成dPCR預(yù)混液，并分裝到8聯(lián)排管中或96孔板中；將各待測樣本的核酸模板、陽性對照、陰性對照分別加入相應(yīng)的8聯(lián)排管中或96孔板中；2）芯片進樣：在小海龜BioDigital·青全自動樣品處理系統(tǒng)上進行芯片上反應(yīng)液進樣和液滴生成；3）芯片擴增：在小海龜BioDigital·青PCR擴增儀上進行芯片上PCR擴增反應(yīng)；4）芯片閱讀：在小海龜BioDigital·青生物芯片閱讀儀上進行芯片上熒光信號閱讀；5）數(shù)據(jù)分析：使用生物芯片數(shù)據(jù)分析·青軟件進行數(shù)據(jù)分析和報告導(dǎo)出；珠三角數(shù)字PCR熒光通道
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