蕪湖成都細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑

細(xì)胞轉(zhuǎn)染的注意事項(xiàng)：1.細(xì)胞鋪板密度用于轉(zhuǎn)染的較佳細(xì)胞密度根據(jù)不同的細(xì)胞類型或應(yīng)用而異。因轉(zhuǎn)染試劑對(duì)細(xì)胞有毒害作用，細(xì)胞太少，容易死。一般轉(zhuǎn)染時(shí)，貼壁細(xì)胞密度為70%-90%，懸浮細(xì)胞密度為2-4×106細(xì)胞/ml，確保轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞沒有長(zhǎng)滿或處于靜止期。因?yàn)檗D(zhuǎn)染效率對(duì)細(xì)胞密度很敏感，所以在不同實(shí)驗(yàn)間保持一個(gè)基本的傳代步驟很重要。鋪板細(xì)胞數(shù)目的增加可以增加轉(zhuǎn)染活性和細(xì)胞產(chǎn)量。細(xì)胞的融合度必須要達(dá)到90%才能做啟動(dòng)子的選擇獲得高轉(zhuǎn)染活性所需選擇的啟動(dòng)子依賴于選用的細(xì)胞系和要表達(dá)的蛋白。CMV啟動(dòng)子在大多數(shù)細(xì)胞類型中可以獲得高表達(dá)活性。同其他啟動(dòng)子，如SV40和RSV(勞斯肉瘤細(xì)菌)相比，在BHK-21中其活性較高。這三種細(xì)菌啟動(dòng)子在T細(xì)胞來(lái)源的細(xì)胞系，如Jurkat中組成表達(dá)水平較低。轉(zhuǎn)染后在培養(yǎng)基中加入PHA-L和PMA可以啟動(dòng)Jurkat細(xì)胞中CMV啟動(dòng)子，而單PMA就足以啟動(dòng)KG1和K562(人骨髓瘤白細(xì)胞)中的CMV啟動(dòng)子。SV40啟動(dòng)子的表達(dá)在含有大T抗原(存在于COS-1和COS-7)時(shí)會(huì)提高，因?yàn)榇骉抗原可以刺激染色體外的合成。通過(guò)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化合適的轉(zhuǎn)染條件對(duì)于轉(zhuǎn)染效率的提高很重要。蕪湖成都細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑

細(xì)胞電轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)的幾點(diǎn)建議：1. 電場(chǎng)強(qiáng)度要合適合適的電場(chǎng)強(qiáng)度對(duì)于電轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)非常重要，電場(chǎng)強(qiáng)度不能過(guò)高，過(guò)高會(huì)增加細(xì)胞的死亡率；也不能過(guò)低，過(guò)低不能增加膜的通透性或在膜上形成小孔。不同細(xì)胞系具有不同的較佳場(chǎng)強(qiáng)值，實(shí)驗(yàn)前應(yīng)測(cè)定所轉(zhuǎn)染細(xì)胞系的較佳電場(chǎng)強(qiáng)度。2. 細(xì)胞狀態(tài)要好用于電轉(zhuǎn)的細(xì)胞一般選取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞（15代以內(nèi)，傳代后2d）。因?yàn)樘幱趯?duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞分裂旺盛，表面結(jié)構(gòu)致密比穩(wěn)定期的細(xì)胞差，電轉(zhuǎn)后，細(xì)胞膜的恢復(fù)能力強(qiáng)，而且處于有絲分裂期的細(xì)胞更容易接受外源DNA.金華濟(jì)南細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑陽(yáng)離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)轉(zhuǎn)染試劑，以其適用宿主范圍廣。

細(xì)胞轉(zhuǎn)染的常用方法：細(xì)菌轉(zhuǎn)染：原理：對(duì)于用脂質(zhì)體不能實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，可以采用細(xì)菌轉(zhuǎn)染?？捎糜诘鞍踪|(zhì)過(guò)表達(dá)或克制，是臨床研究中較常用的方法。它通過(guò)侵染宿主細(xì)胞將外源基因整合到染色體中，可用于難轉(zhuǎn)染細(xì)胞、原代細(xì)胞的穩(wěn)定性轉(zhuǎn)染。實(shí)驗(yàn)步驟：通過(guò)基因克隆生成重組細(xì)菌 → 采用非細(xì)菌法轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞系，擴(kuò)增并分離得到重組細(xì)菌顆?！兓⒌味?xì)菌液→轉(zhuǎn)導(dǎo)目的細(xì)胞（含有細(xì)菌特異性的受體）→去除培養(yǎng)物中的細(xì)菌，并加入新鮮培養(yǎng)基→分析細(xì)胞瞬時(shí)基因表達(dá)或沉默情況。

細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率低下的幾個(gè)大坑：1.不注意細(xì)節(jié)在轉(zhuǎn)染之前更換一次37℃預(yù)溫的培養(yǎng)基，可提高轉(zhuǎn)染效率。脂質(zhì)體和DNA/RNA混合物應(yīng)當(dāng)一滴一滴地滴下來(lái)，從培養(yǎng)皿一邊滴到另一邊，邊滴邊輕搖培養(yǎng)皿，以確保均勻分布和避免局部高濃度。這些都是一些細(xì)枝末節(jié)，但是，如果不注意的話，也會(huì)造成轉(zhuǎn)染效率低下。2.細(xì)胞狀態(tài)不好細(xì)胞狀態(tài)不好，會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率低下。一般進(jìn)行轉(zhuǎn)染的細(xì)胞應(yīng)該處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。如果是貼壁細(xì)胞的話，貼壁率應(yīng)該在70-80%；如果是懸浮細(xì)胞的話，應(yīng)該是6X105個(gè)/孔（24孔板），一般是轉(zhuǎn)染前現(xiàn)在換液，轉(zhuǎn)染前用無(wú)血清培養(yǎng)基或PBS洗細(xì)胞一次。轉(zhuǎn)染的整個(gè)過(guò)程都不應(yīng)該有物品。其可降解性對(duì)體內(nèi)應(yīng)用也具有重要的意義。

細(xì)胞轉(zhuǎn)染那些事兒：1.設(shè)置陰性和陽(yáng)性對(duì)照：一般在轉(zhuǎn)染后24-48h,靶基因即在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)?？梢罁?jù)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?4-48h后即可進(jìn)行靶基因表達(dá)的檢測(cè)等實(shí)驗(yàn)。2.轉(zhuǎn)染后效率的檢測(cè)方法：觀察轉(zhuǎn)染后細(xì)胞熒光情況；qPCR驗(yàn)證；WB檢測(cè)敲減或過(guò)表達(dá)蛋白。3. 轉(zhuǎn)染效率低，可采取以下兩種方法：1 )復(fù)轉(zhuǎn)染，即轉(zhuǎn)染后12-24h再進(jìn)行轉(zhuǎn)染，前提是該細(xì)胞對(duì)脂質(zhì)體的耐受性較好，轉(zhuǎn)染后細(xì)胞死亡數(shù)較少。2 )通過(guò)藥篩來(lái)殺死未轉(zhuǎn)入成功的細(xì)胞，前提是該質(zhì)粒帶有物品抗性的基因。4. 電轉(zhuǎn)時(shí)，不同的細(xì)胞需要的電壓是不一樣的，需要做預(yù)實(shí)驗(yàn)，摸索較佳條件。對(duì)于大多數(shù)細(xì)胞而言，較佳電壓位于250-1250v/cm。電擊后，應(yīng)該將DNA和細(xì)胞混合液在室溫下放置10min,使細(xì)胞恢復(fù)損傷。對(duì)于原代細(xì)胞，可用促有絲分裂刺激物進(jìn)行細(xì)胞活化。金華濟(jì)南細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑

瞬時(shí)表達(dá)分析檢測(cè)未重組質(zhì)粒DNA上基因的表達(dá)。蕪湖成都細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑

如何高效率實(shí)現(xiàn)細(xì)胞轉(zhuǎn)染：瞬時(shí)轉(zhuǎn)染與穩(wěn)定轉(zhuǎn)染常規(guī)轉(zhuǎn)染技術(shù)根據(jù)基因表達(dá)時(shí)間的長(zhǎng)短可分為兩大類，一類是瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，一類是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染（很長(zhǎng)轉(zhuǎn)染）。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中，外源基因得以表達(dá)但它們并不會(huì)整合到細(xì)胞的基因組中，也就不會(huì)被復(fù)制。細(xì)胞中瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的外源基因表達(dá)時(shí)間有限，通常*持續(xù)幾天，直到外源基因在細(xì)胞分裂過(guò)程中因各種因素丟失為止。在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒中往往都含有一個(gè)報(bào)告基因，來(lái)指示細(xì)胞中目標(biāo)基因是否存在，這樣的報(bào)告基因一般可以在轉(zhuǎn)染后一兩天內(nèi)檢測(cè)到。蕪湖成都細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑

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