南昌細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑廠家供應(yīng)

來源: 發(fā)布時間:2024-05-31

穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系的篩選:生長的細(xì)胞比不分裂的細(xì)胞更快的受到GENETICIN物品的影響。轉(zhuǎn)染后,在開始篩選前等待48-72小時,使細(xì)胞表達(dá)足夠量的抗性酶,保證在開始篩選時可以自我保護。轉(zhuǎn)染后48-72小時倒掉培養(yǎng)基,加入含有GENETICIN物品的培養(yǎng)基,物品的濃度根據(jù)劑量反應(yīng)曲線確定,足夠殺死未轉(zhuǎn)染細(xì)胞。因為許多因子影響到篩選所需的GENETICIN物品的較佳濃度,包括細(xì)胞類型,培養(yǎng)基和血清濃度等,所以有必要對每種細(xì)胞作一個劑量反應(yīng)曲線,確定較佳濃度。篩選較多可能需要一周時間,因為在致死劑量的GENETICIN物品存在條件下,細(xì)胞會分裂1-2次。在次培養(yǎng)細(xì)胞時使用較低劑量的物品,一般是篩選劑量的一半。篩選后的細(xì)胞一般是離散的克隆,根據(jù)實驗?zāi)康牟煌?,可以分別純化(克?。?,收集進(jìn)行大量培養(yǎng)或染色并進(jìn)行抗性克隆的計數(shù)。轉(zhuǎn)染試劑的準(zhǔn)備①將400ul去核酸酶水加入管中,震蕩10秒鐘,溶解脂狀物。南昌細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑廠家供應(yīng)

南昌細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑廠家供應(yīng),細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑

轉(zhuǎn)染的注意事項:細(xì)胞鋪板密度用于轉(zhuǎn)染的較佳細(xì)胞密度根據(jù)不同的細(xì)胞類型或應(yīng)用而異。一般轉(zhuǎn)染時,貼壁細(xì)胞密度為70%-90%,懸浮細(xì)胞密度為2×106-4×106細(xì)胞/ml時效果較好。確保轉(zhuǎn)染時細(xì)胞沒有長滿或處于靜止期。因為轉(zhuǎn)染效率對細(xì)胞密度很敏感,所以在不同實驗間保持一個基本的傳代步驟很重要。鋪板細(xì)胞數(shù)目的增加可以增加轉(zhuǎn)染活性和細(xì)胞產(chǎn)量。在三種不同密度進(jìn)行細(xì)胞鋪板的比較表明鋪板密度較高的,CAT活性也較高。得到較高活性所需的LIPOFECTAMINE試劑的量也相應(yīng)增加了。這些結(jié)果說明,對于轉(zhuǎn)染相同量的DNA所需的較佳陽離子脂質(zhì)體試劑的量會因細(xì)胞密度而異~濟南正規(guī)細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑廠家批發(fā)價蛋白表達(dá)和培養(yǎng)基的選擇哺乳動物細(xì)胞系合成可溶的。

南昌細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑廠家供應(yīng),細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑

細(xì)胞轉(zhuǎn)染的常用方法:人工脂質(zhì)體法原理:帶正電的脂質(zhì)體與核酸帶負(fù)電的磷酸基團形成復(fù)合物,進(jìn)而可被細(xì)胞內(nèi)吞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染/瞬時性轉(zhuǎn)染。這種方法幾乎適用于所有細(xì)胞,轉(zhuǎn)染效率高、重復(fù)型好,但轉(zhuǎn)染時需要去除血清,轉(zhuǎn)染效果隨細(xì)胞類型變化大。實驗步驟:在單獨試管中分別稀釋核酸及轉(zhuǎn)染試劑→脂質(zhì)體與核酸的磷酸骨架結(jié)合,形成復(fù)合物→脂質(zhì)體上的正電荷有助于復(fù)合物與細(xì)胞膜結(jié)合→復(fù)合物通過內(nèi)吞作用進(jìn)入胞漿→分析細(xì)胞瞬時基因表達(dá)或沉默情況。

如何高效率實現(xiàn)細(xì)胞轉(zhuǎn)染:DNA轉(zhuǎn)染導(dǎo)入細(xì)胞胞漿內(nèi)的DNA不能穿過細(xì)胞核的核膜("核屏障")。在細(xì)胞有絲分裂過程中核膜溶解,DNA進(jìn)入細(xì)胞核才有可能。為此,細(xì)胞處于分裂期對DNA轉(zhuǎn)染是至關(guān)重要的,并且處于分裂期的細(xì)胞比例必須盡可能大才能實現(xiàn)高效轉(zhuǎn)染。DNA轉(zhuǎn)染機制示意圖如下所示:轉(zhuǎn)染RNA(siRNA/miRNA/mRNA)對于RNA轉(zhuǎn)染是沒有"核屏障"的,因為RNA不需要進(jìn)入細(xì)胞核發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng),因此細(xì)胞分裂對它沒有影響。轉(zhuǎn)染試劑的選擇理想的轉(zhuǎn)染試劑選擇可以使您的實驗如虎添翼!真核細(xì)胞的先天免疫系統(tǒng),使它們能夠檢測外來物質(zhì)如脂多糖、細(xì)菌或細(xì)菌核酸和蛋白質(zhì),并克制潛在病原體的入侵。此外,細(xì)胞通過信使分子向臨近細(xì)胞傳遞發(fā)現(xiàn)有害物質(zhì)的信號。因此,這些臨近細(xì)胞甚至無需接觸病原體即可采取防御方式。這種細(xì)胞先天免疫系統(tǒng)也是轉(zhuǎn)染成功的一個障礙。瞬時和穩(wěn)定表達(dá)DNA轉(zhuǎn)染后,轉(zhuǎn)入基因的表達(dá)可以在1-4天內(nèi)檢測到。

南昌細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑廠家供應(yīng),細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑

細(xì)胞轉(zhuǎn)染實驗注意事項:1.培養(yǎng)基中的物品物品是影響轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)基添加物。這些物品一般對于真核細(xì)胞無毒,但陽離子脂質(zhì)體試劑增加了細(xì)胞的通透性,使物品可以進(jìn)入細(xì)胞。這降低了細(xì)胞的活性,導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率降低。這時候可以選擇Entranster轉(zhuǎn)染試劑,非脂質(zhì)體試劑,培養(yǎng)基可加物品,避免了細(xì)胞染菌。2.設(shè)置陽性對照和陰性對照。3.一般在轉(zhuǎn)染24-48h,靶基因即在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。根據(jù)不同的實驗?zāi)康模?4-48h后即可進(jìn)行靶基因表達(dá)的檢測實驗。4.如若建立穩(wěn)定的細(xì)胞系,則可對靶細(xì)胞進(jìn)行篩選,根據(jù)不同基因載體中所含有的抗性標(biāo)志選用相應(yīng)的藥物,常用的真核表達(dá)基因載體的標(biāo)志物有潮霉素和新霉素等。通過實驗優(yōu)化合適的轉(zhuǎn)染條件對于轉(zhuǎn)染效率的提高很重要。南京北京細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑

一類是瞬時轉(zhuǎn)染,一類是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染(很長轉(zhuǎn)染)。南昌細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑廠家供應(yīng)

細(xì)胞轉(zhuǎn)染的注意事項:物品(PS)物品,比如青霉素和鏈霉素,是影響轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)基添加物。這些物品一般對于真核細(xì)胞無毒,但陽離子脂質(zhì)體試劑增加了細(xì)胞的通透性,使物品可以進(jìn)入細(xì)胞。這降低了細(xì)胞的活性,導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率低。所以,在轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中不能使用物品,甚至在準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染前進(jìn)行細(xì)胞鋪板時也要避免使用物品。這樣,在轉(zhuǎn)染前也不必潤洗細(xì)胞。對于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染,不要在選擇性培養(yǎng)基中使用青霉素和鏈霉素,ICIN選擇性物品的競爭性克制劑。另外,為了保證無血清培養(yǎng)基中細(xì)胞的健康生長,使用比含血清培養(yǎng)基更少的物品量。南昌細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑廠家供應(yīng)