唐山細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)貨價(jià)

細(xì)胞轉(zhuǎn)染簡介：轉(zhuǎn)染，是將外源性基因?qū)爰?xì)胞內(nèi)的一種專門技術(shù)。隨著基因與蛋白功能研究的深入，轉(zhuǎn)染目前已成為實(shí)驗(yàn)室工作中經(jīng)常涉及的基本方法。轉(zhuǎn)染大致可分為物理介導(dǎo)、化學(xué)介導(dǎo)和生物介導(dǎo)三類途徑。電穿孔法、顯微注射和基因?qū)儆谕ㄟ^物理方法將基因?qū)爰?xì)胞的范例；化學(xué)介導(dǎo)方法很多，如經(jīng)典的磷酸鈣共沉淀法、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法、和多種陽離子物質(zhì)介導(dǎo)的技術(shù)；生物介導(dǎo)方法，有較為原始的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)染，和現(xiàn)在比較多見的各種細(xì)菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染技術(shù)。加入混合液，將細(xì)胞放回培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一個(gè)小時(shí)。唐山細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)貨價(jià)

細(xì)胞轉(zhuǎn)染的原理、操作步驟以及小技巧：脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染操作步驟：(1)細(xì)胞培養(yǎng)：取6cm細(xì)胞皿，向每孔中加入2mL含1~2×105個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)液，37℃CO2培養(yǎng)密度至40%~60%，密度過大，轉(zhuǎn)染后不利篩選細(xì)胞。(2)轉(zhuǎn)染液制備：在EP管中制備以下兩液(為轉(zhuǎn)染每一個(gè)孔細(xì)胞所用的量)A液：用不含血清培養(yǎng)基稀釋1ug質(zhì)粒DNA。B液：用不含血清培養(yǎng)基稀釋2ul脂質(zhì)體。分別將A液與B液輕彈混勻，靜置5分鐘。(3)吸取B液加入至A液中，輕彈混勻。室溫中置10-15分鐘。(4)轉(zhuǎn)染準(zhǔn)備：用1mL不含血清培養(yǎng)液漂洗兩次，再加入4mL不含血清培養(yǎng)液。(5)轉(zhuǎn)染：把A/B復(fù)合物緩緩加入培養(yǎng)液中，搖勻，37℃溫箱置6~24小時(shí)，吸除無血清轉(zhuǎn)染液，換入正常培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。(6)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后，可在48h-72h細(xì)胞長滿之后，提取細(xì)胞蛋白或者RNA，驗(yàn)證敲減/過表達(dá)效率。蕪湖正規(guī)細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑廠家蛋白表達(dá)和培養(yǎng)基的選擇哺乳動(dòng)物細(xì)胞系合成可溶的。

細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)簡介：實(shí)驗(yàn)原理外源基因進(jìn)入細(xì)胞主要有四種方法：電擊法、磷酸鈣法和脂質(zhì)體介導(dǎo)法和細(xì)菌介導(dǎo)法。電擊法是在細(xì)胞上短時(shí)間暫時(shí)性的穿孔讓外源質(zhì)粒進(jìn)入;磷酸鈣法和脂質(zhì)體法是利用不同的載體物質(zhì)攜帶質(zhì)粒通過直接穿膜或者膜融合的方法使得外源基因進(jìn)入細(xì)胞;細(xì)菌法是利用包裝了外源基因的細(xì)菌傳染細(xì)胞的方法使得其進(jìn)入細(xì)胞。但是由于電擊法和磷酸鈣法的實(shí)驗(yàn)條件控制較嚴(yán)、難度較大;細(xì)菌法的前期準(zhǔn)備較復(fù)雜、而且可能對于細(xì)胞有較大影響;所以現(xiàn)在對于很多普通細(xì)胞系，一般的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染方法多采用脂質(zhì)體法。

穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系的篩選：生長的細(xì)胞比不分裂的細(xì)胞更快的受到GENETICIN物品的影響。轉(zhuǎn)染后，在開始篩選前等待48-72小時(shí)，使細(xì)胞表達(dá)足夠量的抗性酶，保證在開始篩選時(shí)可以自我保護(hù)。轉(zhuǎn)染后48-72小時(shí)倒掉培養(yǎng)基，加入含有GENETICIN物品的培養(yǎng)基，物品的濃度根據(jù)劑量反應(yīng)曲線確定，足夠殺死未轉(zhuǎn)染細(xì)胞。因?yàn)樵S多因子影響到篩選所需的GENETICIN物品的較佳濃度，包括細(xì)胞類型，培養(yǎng)基和血清濃度等，所以有必要對每種細(xì)胞作一個(gè)劑量反應(yīng)曲線，確定較佳濃度。篩選較多可能需要一周時(shí)間，因?yàn)樵谥滤绖┝康腉ENETICIN物品存在條件下，細(xì)胞會分裂1-2次。在次培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)使用較低劑量的物品，一般是篩選劑量的一半。篩選后的細(xì)胞一般是離散的克隆，根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟煌?，可以分別純化（克隆），收集進(jìn)行大量培養(yǎng)或染色并進(jìn)行抗性克隆的計(jì)數(shù)。轉(zhuǎn)染技術(shù)轉(zhuǎn)染是將外源遺傳物質(zhì)導(dǎo)入真核細(xì)胞的過程，是細(xì)胞和分子生物學(xué)研究的重要工具。

細(xì)胞轉(zhuǎn)染，你至少要掌握以下幾點(diǎn)：主要有下面幾種方法：：化學(xué)法：磷酸鈣法、DEAE-右旋糖苷法、陽離子脂質(zhì)體法；物理法：電穿孔法、顯微注射法、顆粒傳遞法；細(xì)菌介導(dǎo)法：逆轉(zhuǎn)錄細(xì)菌、腺細(xì)菌A.陽離子脂質(zhì)體法：帶正電的脂質(zhì)體與核酸帶負(fù)電的磷酸基團(tuán)形成復(fù)合物被細(xì)胞內(nèi)吞。特點(diǎn)：簡單通用，適用性廣，轉(zhuǎn)染效率高，重復(fù)性好，但轉(zhuǎn)染時(shí)需除血清，轉(zhuǎn)染效率隨細(xì)胞類型變化大。由于脂質(zhì)體復(fù)合物與貼壁細(xì)胞的接觸機(jī)會遠(yuǎn)大于懸浮細(xì)胞，所以貼壁比懸浮轉(zhuǎn)染效率要高。懸浮細(xì)胞建議使用電穿孔法。B.電穿孔法：利用高壓電脈沖對細(xì)胞膜的干擾，使其形成利于核酸進(jìn)入的微孔直到外源基因在細(xì)胞分裂過程中因各種因素丟失為止。深圳細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑廠家供應(yīng)

在一般實(shí)驗(yàn)室中很難普及。其它物理和化學(xué)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染方法，則各有其特點(diǎn)。唐山細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)貨價(jià)

細(xì)胞轉(zhuǎn)染那些事兒：1.設(shè)置陰性和陽性對照：一般在轉(zhuǎn)染后24-48h,靶基因即在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)?？梢罁?jù)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?4-48h后即可進(jìn)行靶基因表達(dá)的檢測等實(shí)驗(yàn)。2.轉(zhuǎn)染后效率的檢測方法：觀察轉(zhuǎn)染后細(xì)胞熒光情況；qPCR驗(yàn)證；WB檢測敲減或過表達(dá)蛋白。3.轉(zhuǎn)染效率低，可采取以下兩種方法：1)復(fù)轉(zhuǎn)染，即轉(zhuǎn)染后12-24h再進(jìn)行轉(zhuǎn)染，前提是該細(xì)胞對脂質(zhì)體的耐受性較好，轉(zhuǎn)染后細(xì)胞死亡數(shù)較少。2)通過藥篩來殺死未轉(zhuǎn)入成功的細(xì)胞，前提是該質(zhì)粒帶有物品抗性的基因。4.電轉(zhuǎn)時(shí)，不同的細(xì)胞需要的電壓是不一樣的，需要做預(yù)實(shí)驗(yàn)，摸索較佳條件。對于大多數(shù)細(xì)胞而言，較佳電壓位于250-1250v/cm。電擊后，應(yīng)該將DNA和細(xì)胞混合液在室溫下放置10min,使細(xì)胞恢復(fù)損傷。唐山細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)貨價(jià)