寧波廣州細胞高效轉染試劑

如何提高細胞轉染效率：1.組織培養(yǎng)試劑優(yōu)化細胞生長條件。只使用新鮮配制的培養(yǎng)基和添加劑，并經(jīng)可能減少所用試劑的變更?；A培養(yǎng)基—目前所使用的各種市售培養(yǎng)基(如，RPMI 1640和DMEM)。培養(yǎng)基的成分包括營養(yǎng)物質(氨基酸，葡萄糖)，維生素，無機鹽，和緩沖物質。有些成分非常不穩(wěn)定，因此如果不在使用時新鮮加入就可能會產(chǎn)生問題。務必要使培養(yǎng)基避光保存。因為已知有一些組分和緩沖物質，如HEPES，當暴露于光照下就會分解產(chǎn)生細胞毒性物質。另外，血清，添加劑，來自于培養(yǎng)箱內的污染物、化學物質，或/細胞的污染也都可能影響到細胞生理。2.細胞生長狀態(tài)密切觀察您的細胞;確保它們狀態(tài)良好。在開始轉染細胞之前，先制定一個適當?shù)姆N板方案，使細胞密度從轉染開始到結束都保持較佳狀態(tài)。增加成功幾率—細胞是轉染過程中的一個關鍵元素，它可以是影響結果的一致性和質量的較重要的變量。轉染試劑與細胞不匹配細胞轉染較適合的不是原代細胞。寧波廣州細胞高效轉染試劑

如何有效提高細胞轉染實驗效率：1.選擇高效的轉染方法不同轉染試劑有不同的轉染方法，但大多大同小異。轉染時應跟據(jù)具體轉染試劑推薦的方法，但也要注意，因不同實驗室培養(yǎng)的細胞性質不同，質粒定量差異，操作手法上的差異等，其轉染效果可能不同，應根據(jù)實驗室的具體條件來確定較佳轉染條件。2.確保所構建載體的質量。轉染載體的構建（細菌載體，質粒DNA，RNA，PCR產(chǎn)物，寡核苷酸等）也影響轉染結果。細菌載體對特定宿主細胞傳染效率較高，但不同細菌載體有其特定的宿主，有的還要求特定的細胞周期，如逆轉錄細菌需侵染分裂期的宿主細胞，此外還需考慮一些安全問題（如基因污染）。除載體構建外，載體的形態(tài)及大小對轉染效率也有不同的影響，如前面提到的超螺旋及線性DNA對瞬時和穩(wěn)定轉染的影響。如果基因產(chǎn)物對細胞有毒性作用，轉染也很難進行，因此選擇組成或可調控，強度合適的啟動子也很重要，同時做空載體及其它基因的相同載體構建的轉染正對照可排除毒性影響的干擾。廈門細胞高效轉染試劑廠家批發(fā)價當復合物接近細胞膜時，通過內吞作用形成內體進入細胞。

細胞轉染的原理、操作步驟以及小技巧：脂質體轉染操作步驟：(1)細胞培養(yǎng)：取6cm細胞皿，向每孔中加入2mL含1~2×105個細胞培養(yǎng)液，37℃ CO2培養(yǎng)密度至40%~60%，密度過大，轉染后不利篩選細胞。(2) 轉染液制備：在EP管中制備以下兩液(為轉染每一個孔細胞所用的量)A液：用不含血清培養(yǎng)基稀釋1ug 質粒DNA。B液：用不含血清培養(yǎng)基稀釋2ul脂質體。分別將A液與B液輕彈混勻，靜置5分鐘。(3)吸取B液加入至A液中，輕彈混勻。室溫中置10-15分鐘。(4)轉染準備：用1mL不含血清培養(yǎng)液漂洗兩次，再加入4mL不含血清培養(yǎng)液。(5)轉染：把A/B復合物緩緩加入培養(yǎng)液中，搖勻，37℃溫箱置6~24小時，吸除無血清轉染液，換入正常培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。(6)瞬時轉染后，可在48h-72h細胞長滿之后，提取細胞蛋白或者RNA，驗證敲減/過表達效率。

細胞轉染的注意事項：1.細胞鋪板密度用于轉染的較佳細胞密度根據(jù)不同的細胞類型或應用而異。因轉染試劑對細胞有毒害作用，細胞太少，容易死。一般轉染時，貼壁細胞密度為70%-90%，懸浮細胞密度為2-4×106細胞/ml，確保轉染時細胞沒有長滿或處于靜止期。因為轉染效率對細胞密度很敏感，所以在不同實驗間保持一個基本的傳代步驟很重要。鋪板細胞數(shù)目的增加可以增加轉染活性和細胞產(chǎn)量。細胞的融合度必須要達到90%才能做啟動子的選擇獲得高轉染活性所需選擇的啟動子依賴于選用的細胞系和要表達的蛋白。CMV啟動子在大多數(shù)細胞類型中可以獲得高表達活性。同其他啟動子，如SV40和RSV(勞斯肉瘤細菌)相比，在BHK-21中其活性較高。這三種細菌啟動子在T細胞來源的細胞系，如Jurkat中組成表達水平較低。轉染后在培養(yǎng)基中加入PHA-L和PMA可以啟動Jurkat細胞中CMV啟動子，而單PMA就足以啟動KG1和K562(人骨髓瘤白細胞)中的CMV啟動子。SV40啟動子的表達在含有大T抗原(存在于COS-1和COS-7)時會提高，因為大T抗原可以刺激染色體外的合成。脂質體轉染法陽離子脂質體表面帶正電荷。

細胞轉染效率低下的幾個大坑：1.試劑過期有時候轉染效率低下，還要考慮會不會存在試劑過期的情況。毛博當年做轉染整整半年，百思不得其解。較后發(fā)現(xiàn)，原來是Lipofectamine 2000過期了。換了之后，立馬成功。根據(jù)我的經(jīng)驗，盡量使用開封半年內的，因為過了半年后，就算沒有過失效期，但是細胞毒性較大增加，而轉染效率卻較大下降。千萬不要為了省錢，影響實驗進度哈。2.未加血清轉染后未及時加入血清，會導致細胞大量死亡。一般要在轉染后的4-6小時換液且換為有血清的培養(yǎng)基。根據(jù)毛博的經(jīng)驗，其實也可以在原來的無血清培養(yǎng)基里面滴加血清。這個時候，較好不要換液，不要打擾細胞，讓它安安靜靜地休息。但是也不能過早加入血清。過早的話，會引起未轉染的細胞瘋狂生長。那么，什么是較佳時機呢？在20%的細胞變圓的時候，就是加血清的較佳時機。細胞密度以及轉染的時間長短和培養(yǎng)基中血清的含量都是影響轉染效率的重要因素。蕪湖正規(guī)細胞高效轉染試劑直銷價

重新接種于培養(yǎng)皿或瓶，較好在轉染前4小時換一次新鮮培養(yǎng)液。寧波廣州細胞高效轉染試劑

如何高效率實現(xiàn)細胞轉染：DNA轉染導入細胞胞漿內的DNA 不能穿過細胞核的核膜（"核屏障"）。在細胞有絲分裂過程中核膜溶解，DNA進入細胞核才有可能。為此，細胞處于分裂期對DNA轉染是至關重要的，并且處于分裂期的細胞比例必須盡可能大才能實現(xiàn)高效轉染。DNA轉染機制示意圖如下所示：轉染RNA(siRNA/miRNA/mRNA)對于RNA轉染是沒有"核屏障"的，因為RNA不需要進入細胞核發(fā)揮其生物學效應，因此細胞分裂對它沒有影響。轉染試劑的選擇理想的轉染試劑選擇可以使您的實驗如虎添翼！真核細胞的先天免疫系統(tǒng)，使它們能夠檢測外來物質如脂多糖、細菌或細菌核酸和蛋白質，并克制潛在病原體的入侵。此外，細胞通過信使分子向臨近細胞傳遞發(fā)現(xiàn)有害物質的信號。因此，這些臨近細胞甚至無需接觸病原體即可采取防御方式。這種細胞先天免疫系統(tǒng)也是轉染成功的一個障礙。寧波廣州細胞高效轉染試劑