南通育種脫靶檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室

R-loop seq雖然不是一種真正意義上的脫靶位點(diǎn)檢測(cè)方法，但能為堿基編輯脫氨酶的脫靶提供一種度量方法，以便于之后的脫氨酶點(diǎn)突變優(yōu)化，來(lái)降低脫靶的發(fā)生幾率。2) Detect-seqCRISPR衍生技術(shù)由于其復(fù)雜性，檢測(cè)其脫靶位點(diǎn)的hexin思路是捕獲實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的關(guān)鍵中間產(chǎn)物或者終產(chǎn)物。這種設(shè)計(jì)思路下，目前較為成功的是檢測(cè)堿基編輯CBE脫靶位點(diǎn)的Detect-seq[13]。CBE的原理是將dC脫氨變?yōu)閐U，迫使其對(duì)側(cè)的dG變?yōu)閐A，較終將堿基對(duì)從C-G轉(zhuǎn)變?yōu)門(mén)-A。Detect-seq便是針對(duì)中間態(tài)的dU，使用Uracil DNA Glycosylase (UDG)，去除U堿基后，替換為帶Biotin的U堿基，捕獲堿基編輯的脫靶位點(diǎn)，并且sgRNA依賴(lài)和sgRNA不依賴(lài)的脫靶位點(diǎn)都能找到。該方法類(lèi)似檢測(cè)DNA甲基化的重亞硫酸鹽測(cè)序法，通過(guò)處理特定的堿基，可以捕獲全基因組上的CBE脫靶位點(diǎn)?；虔煼摪袡z測(cè)，推薦唯可生物，實(shí)驗(yàn)實(shí)力強(qiáng)，專(zhuān)業(yè)性高，檢測(cè)效率高，結(jié)果準(zhǔn)確率高。南通育種脫靶檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室

先導(dǎo)編輯器：CBE和ABE組合使用可以有效地進(jìn)行4種堿基轉(zhuǎn)換（C→T, G→A, A→G, T→C），而無(wú)需產(chǎn)生DSB，然而除了這4種堿基轉(zhuǎn)換，對(duì)另外8種堿基轉(zhuǎn)換（C→A, C→G, G→C, G→T, A→C, A→T, T→A, T→G）以及堿基的插入和缺失，依然缺乏有效的研究工具。先導(dǎo)編輯器（Prime Editor, PE），PE在不依賴(lài)DSB和供體DNA的條件下便可有效實(shí)現(xiàn)所有12種堿基轉(zhuǎn)換，此外還能有效實(shí)現(xiàn)多堿基的精細(xì)插入（較多可插入44bp）和刪除（較多刪除80bp）。> 抗CRISPR蛋白?？笴RISPR（Acr）蛋白是天然的CRISPR/Cas系統(tǒng)抑制劑，由各種可移動(dòng)遺傳元件（MGEs）編碼，在不同階段抑制CRISPR-Cas的免疫功能。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多達(dá)45個(gè)Acr蛋白，其中 "AcrIIA4 "有可能保護(hù)細(xì)胞免受編輯。Shin和他的同事發(fā)現(xiàn)，通過(guò)調(diào)整AcrIIA4或Cas9加入實(shí)驗(yàn)的時(shí)間，AcrIIA4將脫靶修飾減少了4倍，而沒(méi)有減少靶向效應(yīng)。武漢crispr脫靶檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室脫靶檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室，推薦唯可生物，實(shí)驗(yàn)實(shí)力強(qiáng)，專(zhuān)業(yè)性高，檢測(cè)效率高，結(jié)果準(zhǔn)確率高。

堿基編輯器：CBE：胞嘧啶堿基編輯器(Cytosine base editor，CBE)，依賴(lài)于胞嘧啶核苷脫氨基酶，通過(guò)將胞嘧啶核苷脫氨轉(zhuǎn)換為尿嘧啶核苷，尿嘧啶核苷在DNA復(fù)制和修復(fù)過(guò)程中會(huì)轉(zhuǎn)換為胸腺嘧啶核苷，從而實(shí)現(xiàn)C到T的轉(zhuǎn)換。已開(kāi)發(fā)出四代CBE（BE1、BE2、BE3和BE4），由于BE3引起的脫靶效應(yīng)相對(duì)較少，因此它已在動(dòng)物（小鼠）、細(xì)菌和植物細(xì)胞中廣用于編輯細(xì)胞的基因組成。腺嘌呤堿基編輯器(Adenine base editor，ABE)，依賴(lài)于腺嘌呤核苷脫氨基酶，通過(guò)將腺嘌呤核苷脫氨轉(zhuǎn)換為次黃苷，然后在DNA復(fù)制和修復(fù)過(guò)程中會(huì)轉(zhuǎn)換為鳥(niǎo)嘌呤核苷，從而實(shí)現(xiàn)腺嘌呤(A)到鳥(niǎo)嘌呤(G)的轉(zhuǎn)換。新開(kāi)發(fā)的堿基編輯器ABE8e，比ABE7.10增加了590倍的靶向活性。

近幾年，細(xì)胞和基因zhiliao（cell & gene therapy，CGT）領(lǐng)域發(fā)展迅猛，在多個(gè)方向取得了重大突破，以anti-CD19和BCMA為代的多種CAR-T免疫細(xì)胞療法攻克了一部分血液瘤，多種AAV療法也給一些難以成藥的罕見(jiàn)病提供了有效的zhiliao方案。另一方面，基于CRISPR基因編輯技術(shù)的眾多基因療法也進(jìn)展迅速，較早體外基因編輯療法較快今年年底能夠上市（CRISPR Therapeutics CTX001），體內(nèi)基因編輯療法取得了不錯(cuò)的臨床數(shù)據(jù)（Intellia Therapeutics NTLA-2001），使用CRISPR技術(shù)制造的通用型CAR-T療法也是免疫細(xì)胞療法發(fā)展的一大趨勢(shì)（Caribou Biosciences CB-010）。選擇潛在的脫靶位點(diǎn)，例如選擇gRNA預(yù)測(cè)網(wǎng)站上Top 5潛在脫靶位點(diǎn)，進(jìn)行Sanger測(cè)序單克隆；

    基因編輯脫靶檢測(cè)方法：ChIP-seq：利用缺乏DNA切割活性的dCas9結(jié)合DNA的特性，進(jìn)行全基因組范圍的結(jié)合情況檢測(cè)，以評(píng)估潛在的脫靶位點(diǎn)。IDLVcapture：基于非同源末端連接（NHEJ）的DNA修復(fù)過(guò)程，通過(guò)轉(zhuǎn)染篩選基因的IDLV進(jìn)行篩選，以確認(rèn)脫靶位點(diǎn)。GUIDE-seq：利用雙鏈DNA斷裂（DSB）位點(diǎn)的非同源末端連接過(guò)程中可以連入雙鏈DNA的特性，通過(guò)引入短雙鏈寡核苷酸來(lái)標(biāo)記CRISPR/Cas9切割的DSB，進(jìn)而確定脫靶突變的位置。LAM-HTGTS：基于CRISPR/Cas9等造成的DSB可能導(dǎo)致染色質(zhì)DNA的易位連接，通過(guò)檢查這些易位連接位點(diǎn)來(lái)識(shí)別潛在的脫靶位點(diǎn)。BLESS/BLISS/End-seq/DSBCapture等：這些方法通過(guò)直接在DSB位點(diǎn)連入接頭，捕獲DSB位點(diǎn)，結(jié)合高通量測(cè)序技術(shù)進(jìn)行脫靶位點(diǎn)檢測(cè)。DISCOVER-seq：利用DNA修復(fù)因子（如MRE11）結(jié)合染色質(zhì)免疫共沉淀和高通量測(cè)序的方法，捕獲CRISPR/Cas9造成的DSB位點(diǎn)，進(jìn)而鑒定潛在的脫靶位點(diǎn)。 脫靶檢測(cè)技術(shù)是一系列針對(duì)CRISPR/Cas9系統(tǒng)作用機(jī)制研發(fā)的用于確定CRISPR/Cas9系統(tǒng)基因編輯準(zhǔn)確性檢測(cè)工具。寧波crispr/cas9脫靶檢測(cè)技術(shù)

脫靶檢測(cè)評(píng)估，推薦唯可生物，實(shí)驗(yàn)實(shí)力強(qiáng)，專(zhuān)業(yè)性高，檢測(cè)效率高，結(jié)果準(zhǔn)確率高。南通育種脫靶檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室

    常用的脫靶檢測(cè)方法DISCOVER-Seq：使用混雜的gRNAs在小鼠體內(nèi)比較測(cè)試，通過(guò)純化的DNA鑒定推測(cè)的脫靶位點(diǎn)，并使用擴(kuò)增子NGS進(jìn)行詳盡地驗(yàn)證。VIVO：一種目前常用的檢測(cè)方法，使用純化的DNA鑒定出推測(cè)的脫靶位點(diǎn)。Detect-seq：一種針對(duì)堿基編輯器（CBE）的體外脫靶檢測(cè)技術(shù)，通過(guò)檢測(cè)dU（尿嘧啶）的轉(zhuǎn)變來(lái)評(píng)估脫靶效應(yīng)。SAFETI：一種檢測(cè)堿基編輯器體內(nèi)脫靶效應(yīng)的新方法，通過(guò)轉(zhuǎn)基因小鼠系統(tǒng)性地評(píng)估基因編輯工具的安全性。全基因組測(cè)序（WGS）：對(duì)編輯物種的全基因組進(jìn)行測(cè)序，與參考基因組進(jìn)行比對(duì)，較全檢測(cè)基因編輯導(dǎo)致的變異。 南通育種脫靶檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室